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等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）电泳技术 

　　等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。

　　⒈IEF的基本原理在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。

　　⒉pH梯度的组成pH梯度的组成方式有二种，一种是人工pH梯度，由于其不稳定，重复性差，现已不再使用。另一种是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物，在正极端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在负极端引入碱液，如氢氧化钠、氨水等。电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH相等，用pH0表示。电泳开始后，混合物中pH最低的分子，带负电荷最多，pI1为其等电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。由于两性电解质具有一定的缓冲能力，使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。pH稍高的第二种两性电解质，其等电点为pI2，也移向正极，由于pI2＞pI1，因此定位于第一种两性电解质之后，这样，经过一定时间后，具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列，形成了从正极到负极等电点递增，由低到高的线性pH梯度，如图16-3所示。

　　⒊两性电解质载体与支持介质理想的两性电解质载体应在pI处有足够的缓冲能力及电导，前者保证pH梯度的稳定，后者允许一定的电流通过。不同pI的两性电解质应有相似的电导系数从而使整个体系的电导均匀。两性电解质的分子量要小，易于应用分子筛或透析方法将其与被分离的高分子物质分开，而且不应与被分离物质发生反应或使之变性。

　　常用的pH梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等，其中聚丙烯酰胺凝胶为最常应用。

　　电泳后，不可用染色剂直接染色，因为常用的蛋白质染色剂也能和两性电解质结合，因此应先将凝胶浸泡在5％的三氯醋酸中去除两性电解质，然后再以适当的方法染色。

转移电泳技术 
 
（一）原理
    转移电泳是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出的蛋白质谱直接转移到硝酸纤维膜上，而形成固定相，并同时排除各种干扰物质，保持其天然构象和生物学活性，完成在凝胶中难以进行的各种生物试验。
（二）材料
1．琼脂糖
2．丙烯酰胺
3．甲叉双丙烯酰胺
4．十二烷基磺酸钠（SDS）
5．硝酸纤维膜滤纸  孔径0.45μm
6．琼脂糖凝胶电泳缓冲液  0.89mMol/L Tris—89mmol/L 硼酸—2.5mMol/L EDTA（pH8.3）。
    7．SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液  0.05Mol/L Tris—0.384Mol/L 甘氨酸—0.1％SDS（pH8.3）。
    8．蛋白质转移电泳缓冲液  25mMol/L Tris—192mMol/L 甘氨酸—20％甲醇（pH8.3）。
    9．溴乙啶溶液  称取5mg溴乙啶，用无离子水溶解。定容到10ml，取1ml稀释到1 000ml，最终浓度为0.5ug/ml。
    10．考马斯亮兰R－250染色液  0.25％考马斯亮兰R－250－10％醋酸－45％甲醇。
    11．氨基黑染色液  在含10％醋酸的甲醇中加入氨基黑10B至饱和。
    12．垂直板型及水平板型凝胶电泳槽
    13．转移电泳槽
    14．直流稳压电源0V~800V，0mA~100mA
（三）操作方法
  1．SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳（垂直板型）分离蛋白质。
  ⑴凝胶的制备：
丙烯酰胺                                      15.00g
甲叉双丙烯酰胺                                0.40g
0.37Mol/L Tris—HCl（pH8.3）                    50ml
  此为丙烯酰胺母液，过滤后4℃保存备用。
      丙烯酰胺母液                                  8.30ml
N、N、N、N—四甲基乙二胺（DEMED）          250ul
10％SDS                                      0.25ml
0.375Mol/L pH8.8 Tris－HCl                      16.45ml
  混合即为10％分离胶。
      丙烯酰胺母液                                  1.30ml
TEMED                                        15.00ul
10％SDS                                      0.10ml
0.125Mol/L pH6.8Tris－HCl                      8.60ml
制成4％浓缩胶。
    将分离胶与浓缩胶真空抽气10min~15min，备用。
    ⑵凝胶板的制备及加样：取1％的琼脂将凝胶膜底部的缝隙封固。在10％的分离胶中加入10％过硫酸铵0.25ml，混匀后，立即沿玻璃壁缓缓加入胶膜中，上端留出5cm的高度，然后用带有细针头的注射器轻轻地向胶面加入蒸馏水，静置数分钟，水胶界面消失，约20min～30min界面清晰（凝胶已聚合），用注射器将水吸出，并用滤纸吸干余水。在4％浓缩胶中加入10％过硫酸铵0.4ml，混匀后，沿玻璃壁缓慢倒入已聚合的分离胶的上面，立即插进样品槽模板。待凝胶聚合后（约20min～30min），轻轻拔出样品槽模板。将电泳缓冲液加入上、下电泳槽。
  将分离的蛋白质样品用0.01Mol/L Tris－HCl（pH8.0）－0.001Mol/L EDTA－1％SDS－5％硫基乙醇溶液作1︰1稀释，100℃加热处理3min之后，加入甘油10％及适当量溴酚兰，用微量注射器将样品注入样品槽中，蛋白质最后浓度一般为0.05mg／ml～1mg／ml。
    ⑶电泳：上端接阴极，下端接阳极。电压120V、电流30mA，电泳时间5h~6h，待染料泳至距底部约1cm处时断电。
    ⑷染色：切下一部分凝胶，用考马斯亮兰R－250染色作为对照。其余部分作转移电泳。

双向电泳 

    蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心. 双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化. 双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离. 目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10 000个斑点(spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行.
    样品制备(sample prepareation)和溶解同样事关2-DE的成效，目标是尽可能扩大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白，两者联合有协同作用. 对IEF(isoelectric focusing)样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物质. 理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理. 而离液剂2 mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilized pH gradients)胶上的转换. 三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP )取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键，增强了蛋白的溶解度，并导致转至第二向的增加］. 两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度，作为互补试剂会更有效. 在保持样品的完整性的前提下，可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA). 除此之外，机械力被用来对蛋白分子解聚，如超声破碎］等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制剂，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的，可在其水化的过程中加样，覆盖整个IPG胶，避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失］. 此外，低丰度蛋白(low abundance protein)在细胞内可能具有重要的调节功能，代表蛋白质组研究的“冰山之尖”，故分离低丰度蛋白是一种挑战. 亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到1～15 mg级的标准)、应用敏感性检测，可以提高其敏感性. 如一种多肽免疫2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测. 提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白(basic proteins)的分离是另一难点. 由于碱性pH范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生，对PI(等电点)超过10的碱性蛋白，通过产生0～10%的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之. 亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性. 
    2-DE面临的挑战是高分辨率和重复性. 高分辨率确保蛋白最大程度的分离，高重复性允许进行凝胶间配比(match). 对2-DE而言，有3种方法分离蛋白：1)ISO-DALT(isoelectric focus)以O’Farrell’s技术为基础. 第一向应用载体两性电解质(carrier ampholyte, CA)，在管胶内建立pH梯度. 随着聚焦时间的延长，pH梯度不稳，易产生阴极漂移. 2) NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis)用于分离碱性蛋白(pH>7.0). 如果聚焦达到平衡状态，碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失. 因此，在等电区域的迁移须在平衡状态之前完成，但很难控制. 3)IPG-DALT发展于80年代早期. 由于固相pH梯度(Immobilized pH gradient, IPG)的出现解决了pH梯度不稳的问题. IPG通过immobiline共价偶联于丙烯酰胺产生固定的pH梯度，克服了IEF的缺点，从而达到高度的重复性. 目前可以精确制作线性、渐进性和S型曲线，范围或宽或窄的pH梯度. 新的酸性pH 3～5或碱性pH 6～11的IPG凝胶梯度联合商品化的pH 4～7的梯度可对蛋白质形成蛋白质组重叠群(proteomic contigs)从而有效分离.
    分离后的斑点检测(spot detection)亦很重要. 所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外，还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性. 目前，没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和PI及分离后分析技术. 银染已成为一种检测2-DE的流行方法，可检测少到2～5ng的蛋白，因此较考马斯亮蓝R-250敏感. 多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色，一些有机染料不适于PVDF膜. 放射性标记不依赖其代谢的活性，并仅适于对合成的蛋白质检测. 另有一种改良的2-DE(差异凝胶电泳)，即应用两种不同的染料荧光标记两个样品，使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个，避免了几种2-DE的比较，可在纳克级进行检测.
    较早期相比，2-DE有两个主要的进步：首先，极高的重复性使有机体的参考图谱，可通过Internet获得，来比较不同组织类型、不同状态的基因表达；其次，高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术.

高压电泳技术 
 
（一）原理
同普通电泳。普通电泳的电压一般为2V/cm~20V/cm，电泳时间需1小时至数小时。电泳时间越长，扩散越严重。对于一些小分子的物质如核苷酸、氨基酸、多肽等，在常压电泳中，往往达不到分离的目的。高压电泳则能使分子量相近的物质充分地进行分离。在高压电泳中，电压可达到50V/cm～200V/cm，高压电源达1 500V～1 0000V，电流可达50mA～400mA.电压越高，分离时间越短，所以在高压电泳中，一般只需较短的时间,数十分钟，有的甚至数分钟即可达到分离的目的。
高压电泳广泛地用于核苷、核苷酸、氨基酸、多肽、糖、生物碱、有机酸等的分离。
高压电泳中最大的问题是冷却，常用的冷却方式有三种，即固体冷却、液体冷却和气体冷却。其中以液体冷却设备简单、效果也好。液体冷却剂的选择必须遵循以下几点：①与缓冲液互溶性小；②不溶解样品；易从纸上除去；不以爆炸；蒸汽不是剧毒性物质。一般常用的冷却剂有甲苯、四氯化碳、液体石蜡、氯苯、正己烷、乙庚烷等。以甲苯冷却效率最高。
（二）材料与试剂
    1．0.05mol/L pH4.85柠檬酸缓冲液
    2．5－AMP、ADP、ATP，每种核苷酸溶液的浓度为5mg/ml。
3．AMP－ADP－ATP混合液。取上述三种核苷酸溶液等体积混合而成。
4．点样管、毛细管
5．新华1号滤纸
6．玻璃喷雾器
7．高压电泳仪
8．聚乙烯膜等
（三）操作方法
1．剪纸  剪适当大小滤纸，一般为60cm×10cm。
2．点样  点样的位置取决于样品的性质和缓冲液的pH，如不明确泳动方向，则点中线处。核苷酸在pH2～5均带负电荷，点靠负极一些。量为50μg～100μg，要求分离后每个斑点在5μg以上，否则在紫外灯下很难检查出来。点样时，样品越少越好，样品剂量较大时，可边点边用吹风机吹干，分数次点。注意勿伤纸面，不要把纸刮毛或弄皱。
3．电泳  以0.05Mol/L pH4.85柠檬酸缓冲液，用玻璃喷雾器将滤纸喷湿，然后将喷湿的滤纸夹在二滤纸之间，以吸去多余的液体。将湿滤纸夹在两张聚乙烯膜之间，该膜使滤纸与冷却板绝缘，将此“夹层”夹在两块冷却板之间，旋紧冷却板的螺丝。在滤纸两头与电极槽缓冲液之间用数层滤纸搭桥，将电泳仪上的安全盖盖好，把冷却板上入水孔用橡皮管连上。将电表头电压调至4 000V，此时电流为28mA~30mA，相当于电势差66.6V/cm，电流2.8mA/cm~30mA/cm，通电20min，断电。迅速取出滤纸，吹干。
（四）结果判定
用紫外灯（波长260nm）观察滤纸上的核苷酸分离情况。参照核苷酸的移动位置，可以确定结合物（样品）中有何种核苷酸。也可以根据实验条件，先确定各种标准核苷酸的迁移率作为分析的依据。