结 果
1. NAC对HepG2细胞生长的影响:H2O2 1mmol/L诱导6h时细胞开始出现形态学改变,由正常的贴壁多边形开始出现收缩、变圆,胞浆内出现空泡,3mmol/L时最明显,5mmol/L开始有较多细胞死亡脱落。随着H2O2浓度增加,细胞活力逐渐下降,有明显的浓度效应关系。分别用10mmol/L或20mmol/L NAC和不同浓度的H2O2共同孵育HepG2细胞6h,发现NAC可提高在H2O2诱导下HepG2细胞的活力,且随NAC浓度增加而逐渐明显,NAC 20mmol/L时细胞活力最高,见图1。
2. NAC对H2O2诱导的HepG2细胞凋亡的影响:用不同浓度H2O2(0、1、3、5mmol/L)诱导HepG2细胞6h,以Annexin Ⅴ-异硫氰酸荧光素和碘化丙啶荧光素联合标记,流式细胞仪检测凋亡率,发现随H2O2浓度增加,细胞早期凋亡率逐渐升高,分别为0.7%±0.5%、26.4%±1.8%、29.7%±1.2%、51.2%±9.4%,t=2.45,P<0.05,差异有统计学意义,见图2。用NAC(10、20mmol/L)与3mmol/L H2O2共孵育细胞,凋亡率由单独用3mmol/L H2O2诱导6h时的29.7%±1.2%降至23.3%±4.7%和14.3±1.2%,t=2.09,P<0.05,差异有统计学意义,见图3。细胞凋亡晚期染色质DNA被降解为180~200bp整倍数的寡核苷酸片段,DNA凝胶电泳呈现为特征性的“梯形条带”。本研究发现用3、5mmol/L H2O2诱导HepG2细胞6h出现明显的梯度改变,将NAC(10、20mmol/L)与3mmol/L H2O2共同孵育HepG2细胞6h后,DNA梯度分析发现凋亡条带消失。说明NAC可阻止H2O2作用下细胞凋亡的发生,且随着NAC浓度的增加,凋亡率下降越明显。
3. NAC对H2O2诱导的HepG2细胞凋亡信号蛋白表达的影响:随着H2O2浓度增加,内质网分子伴侣GRP78的表达量逐步增加,5mmol/L时达高峰,用NAC 10mmol/L干预后,表达量有所下降,20mmol/L时进一步下降。而ER应激的特异性标志Caspase-12逐步被裂解活化而表达降低,用NAC干预后,酶原表达逐渐恢复。而ADP多聚酶的表达随凋亡的加重,活化片段逐渐增加,用NAC干预后,活化片段逐渐减少,见图4。
4. NAC对ROS生成的影响:不同浓度H2O2 (0、1、3、5mmol/L)诱导HepG2细胞6h后发现,可测到ROS的HepG2细胞平均比例分别为14.0%±0.5%、95.2%±0.1%、97.5%±0.2%、98.3%±0.2%,提示随着H2O2浓度升高,细胞内ROS的生成也逐渐增加。将NAC(10、20mmol/L)与3mmol/L H2O2共同孵育HepG2细胞6h后,检测ROS时发现,产生ROS的细胞平均比例由单独用3mmol/L H2O2诱导6h时的97.5%±0.2%降至52.2%±0.8%与51.2%±2.9%,说明NAC能部分抑制由H2O2诱导产生的ROS,t=2.80,P<0.05, 差异有统计学意义。
讨 论
NAC能刺激谷胱甘肽合成,增强谷胱甘肽S转移酶的活性,尽管人们认为NAC保护肝细胞的作用主要是促进解毒以及对氧自由基反应的直接抑制,从而减轻肝脏损伤,但对NAC抑制肝细胞凋亡的作用机制目前尚未完全了解。本研究采用H2O2诱导HepG2细胞产生ROS,介导ER氧化应激引起的肝细胞凋亡,探讨NAC对ER氧化应激介导的HepG2细胞凋亡的阻抑作用。
最近的研究证实,非酒精性脂肪肝、胆汁淤积和酒精性肝病、HBV和HCV感染等肝脏疾病的发病机制均与ER应激引起的损伤有关[1]。多种因素如缺血缺氧、缺乏生长因子、钙失衡、自由基及药物等可引起内质网应激,其中ROS所致的氧化应激与ER介导的肝细胞凋亡途径密切相关。研究表明,金属离子、细胞内谷胱甘肽的耗竭、生长因子的缺乏、细菌或病毒感染以及一些物质的氧化代谢均能促进ROS的生成。ROS包括:过氧化氢(H2O2),羟自由基(OH),超氧阴离子(O22-)。人体内ROS主要来源于线粒体,ER与溶酶体也能产生ROS[2]。线粒体、膜脂质、蛋白、核基因、均可成为ROS攻击的目标。ER既是ROS的重要来源之一,也是ROS攻击的重要目标之一[3]。因此活性氧的产生是导致ER发生氧化应激从而介导肝细胞凋亡的重要因素之一。
ER是蛋白质正确折叠和钙离子储存的场所。ER膜上有一种RNA倚赖的蛋白激酶样eIF-2a激酶/(PERK),内质网分子伴侣GRP78结合于PERK上,抑制其磷酸化。在ROS的作用下一方面ER腔内蛋白质被氧化修饰,使ER腔内错误折叠和非折叠蛋白积聚,发生非折叠蛋白反应,此时GRP78则从PERK上解离而改为与非折叠蛋白结合,失去GRP78的PERK则发生磷酸化。磷酸化的PERK使eIF-2a发生磷酸化,继而活化下游Caspase-12酶原从而导致凋亡[4]。Caspase-12酶原主要存在于ER,ER损伤可特异性地使其活化,使Caspase-12酶原(约60×103)被切割形成活化的Caspase-12(约12×103),非ER应激的凋亡途径不引起Caspase-12活化[5]。另一方面细胞内氧自由基增加,三磷酸腺苷大量消耗,可使ER的钙通道失活,造成ER腔内钙离子释放至胞浆,使细胞内钙离子失衡[6],最终导致凋亡[7,8]。
NAC作为巯基合成的前体,能对氧自由基反应有直接抑制作用,从而抑制凋亡[9]。本研究结合国内外报道及已有的工作基础,采用了不同浓度的H2O2诱导HepG2细胞6h,建立ER氧化应激凋亡模型。动态观察发现在光学显微镜下贴壁细胞凋亡表现为皱缩、变圆,胞浆内出现空泡和细胞脱落, 随后出现细胞凋亡、坏死。随着H2O2浓度的增加, 细胞活力逐步下降;流式细胞仪检测发现细胞凋亡率逐渐增加;3mmol/L时细胞呈明显的凋亡形态改变,DNA电泳显示出典型的凋亡片段;DHR被泵入线粒体内后,被细胞内ROS所氧化,从而维系在细胞内,经过一定时间的累积,即可通过流式细胞仪检出相应的荧光。本研究用流式细胞仪检测细胞内ROS在H2O2作用下产量增加,NAC干预后产量下降;H2O2作为一种强氧化剂使细胞产生大量ROS,以往人们多关注于其干扰线粒体氧化呼吸链,参与线粒体途径凋亡。本研究采用Western blot检测发现,H2O2诱导HepG2细胞凋亡过程中伴随有ER的分子伴侣GRP78表达的增加,ER应激特异关键性蛋白酶Caspase-12的活化,以及ADP多聚酶的降解。提示H2O2所致的HepG2细胞凋亡与内质网应激介导的凋亡信号通路密切相关。用NAC干预后发现,细胞活力逐步升高、DNA凋亡片段消失、 ROS的产生减少、凋亡信号蛋白表达降低。由此,NAC能抑制ROS的产生,从而抑制内质网氧化应激介导的HepG2细胞凋亡的发生。这一研究结果为临床上NAC治疗各种肝脏疾病,阻止肝脏损伤提供一定的理论基础。
参 考 文 献
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