主题：【资料】乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定

乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定—L(-)-羟脯氨酸含量测定法
1    主题内容与适用范围
本方法规定了乳与乳制品制品中L(-)-羟脯氨酸含量的测定方法。
本方法适用于乳与乳制品中L(-)-羟脯氨酸含量的测定。
本方法通过对L(-)-羟脯氨酸含量的测定，可判定是否为动物水解蛋白。
2  引用标准
GB9695.23-90 肉与肉制品L(-) - 羟脯氨酸含量测定
3  原理
试样经酸水解,释放出羟脯氨酸。经氯胺T氧化,生成含有吡咯环的氧化物。用高氯酸破坏过量的氯胺T。羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物,在波长558nm处进行比色测定。
4  试剂
所用试剂均为分析纯,水为蒸馏水或同等纯度的水。
4.1  氯化亚锡(GB638):0.75％溶液。
将氯化亚锡7.5g溶于500mL水中,再加入500ml浓盐酸(GB 622)。
4.2  盐酸(GB622):6mol/L溶液。
4.3  氢氧化钠(GB629);1mol/L、10mol/L溶液。
4.4  缓冲液:将50g柠檬酸,26.3g氢氧化钠和146.1g结晶乙酸钠(GB694)溶于水,稀至1L,此溶液与200mL水和300mL正丙醇混合。
4.5  氯胺T(HG3-972)溶液:将1.41g氯胺T,溶于10mL水中,依次加入10mL正丙醇和80mL缓冲溶液(用时现配)。
4.6  显色剂:称取10g对二甲氨基苯甲醛,用35mL高氯酸(GB623)溶解,缓慢加入65mL异丙醇。
4.7  L(-)-羟脯氨酸(C5H9NO3)标准溶液。
4.7.1  标准储备液500μg/mL:称取50.0mg/L(-)-羟脯氨酸用少量水溶解,加一滴6mol/L盐酸,定容至100mL容量瓶中。
4.7.2  标准工作液5μg/mL:吸取标准储备液5.00mL于500mL容量瓶中,定容。
 
5.1  实验室常规设备。
5.2  配有冷凝管的三角瓶:250mL。
5.3  恒温水浴。
5.4  试管加热器或水浴,可控温于60℃。
5.5  分光光度计。
6  试样处理：
6.1  方法1：准确称取样品2-5g（液体样品5-10g）放入250mL磨口三角瓶中。加几粒沸石。加入氯化亚锡溶液100mL,置于水浴上加热回流16h。趁热将水解溶液过滤于200mL容量瓶中,用6moL/L热盐酸10mL反复三次冲洗三角瓶和滤纸,冷却,用水定容到刻度,混匀。吸取5～25mL(V1)水解液于100mL烧杯中,用10mol/L、1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为8±0.2,过滤于250mL容量瓶中,用30mL水冲洗烧杯和滤纸上的氢氧化亚锡沉淀,反复三次,把洗液并入滤液中,以水洗至刻度,摇匀备用。
6.2  方法2：准确称取一定量样品，精确到0.0001g。使样品蛋白质含量在10～20mg范围内；将称好的样品放于水解管中。在水解管内加6mol/L盐酸10～15mL（视样品蛋白质含量而定）或加入12mol/L盐酸10～15mL，含水量高的样品（如牛奶）可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚（3.3）3～4滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空（接近0 psi），然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在110±1℃的恒温干燥箱内，水解24h后（如加入12mol/L盐酸，水解时间可缩短至6h）后，取出冷却。
打开水解管，趁热将水解溶液过滤于100mL三角瓶中,用6moL/L热盐酸10mL反复三次冲洗试管和滤纸,冷却,用水定容到刻度,混匀。吸取5～25mL(V1)水解液于100mL三角瓶中,用10mol/L、1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为8±0.2,过滤于50mL容量瓶中,用水冲洗烧杯和滤纸上的氢氧化亚锡沉淀,反复三次,把洗液并入滤液中,以水洗至刻度,摇匀备用。
7  分析步骤
7.1 测定
7.1标准曲线的绘制
吸取L(-)-羟脯氨酸标准工作液0.00,10.00,20.00,30.00,40.00mL,分别置于100mL容量瓶中,定容摇匀。浓度分别为0.0,0.5,1.0,1.5,2.0μg/mL。取不同浓度的上述溶液4.00mL,分别加入20mL具塞试管中,加氯胺T溶液2mL,摇匀后于室温放置20min。加入显色剂2mL,摇匀,塞上塞子于60℃试管加热器(或恒温水浴)中保温20min后取出,迅速冷却,在波长558±2nm处测定吸光值,绘制标准曲线。
7.2  试样测定
从待测液中吸取已制备好的样液4.00mL于20mL具塞试管中,以下按7.1步骤进行,同时作空白试验。
8  分析结果的计算
        C•V1•A
X= ───————×100
        m×1000
式中:X——样品中L(-)-羟脯氨酸的含量,％;
C——从标准曲线上查得相应的L(-)-羟脯氨酸量,μg;
m——称取试样的质量,g;
V1——样液体积,mL。
A——稀释倍数
当符合允许差所规定的要求时,取两次测定结果的算术平均值作为结果,结果精确到0.01％。
9  允许差
同一分析者同时或相继进行的两次测定结果之差不得超过平均值的5％。
10  判定方法
因L(-)-羟脯氨酸为胶原蛋白中的特有组分，其含量占10%以上；而乳蛋白中不含有此成分，如若样品中含有L(-)-羟脯氨酸，可判定添加了动物水解蛋白。

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