主题：【原创】蛋白质重组表达研究简述－－从基因克隆到蛋白纯化及功能研究

继续基因克隆的部分
  －－－基因组的提取
不同来源的基因组提取方法有着类似之处，但同时也存在着比较大的差异。如植物组织，动物组织，动物的排泄物，动物培养细胞，酵母，细菌等等不同。

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有
1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。
2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法
3生物方式:酶法。

根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等

一个关于DNA提取的基本原理：

即使是很多商品化的试剂盒也会基于这样的原理。只是DNA的纯化部分采取了膜吸附的方式而已。。。


苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在NaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

真核细胞DNA的制备

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：

1、防止和抑制DNase对DNA的降解。

2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

试剂准备：

1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。

3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4、20%SDS

5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、无水乙醇、75%乙醇

试验步骤：

材料处理：

1、新鲜或冰冻组织处理：

1)取组织块0.3-0.5cm3剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。

2)将匀浆液转移到1.5ml离心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。

4)60 C水浴1-3hr。

2、培养细胞处理：

1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。

2)离心4000g 5min，去除上清液。

3)加10倍体积的裂解缓冲液。

4)50-55 C水浴1-2hr。

DNA提取：

1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。

2、离心5000g 10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。

3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g 10min，取上层水相到另一管中。

4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g 10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。

5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g 10min，取上层水相到另一管中。

6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。

7、待絮状物出现后，离心5000g 5min，弃上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g 3min，弃上清液。

9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

植物组织中DNA的提取

技术资料都是参考来的，基本上都差不多。。


试验原理：

脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

植物DNA的SDS提取法：

试验试剂：

1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。

2、10 SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3、1 SSC溶液：用10 SSC溶液稀释10倍。

4、0.1 SSC溶液：用1 SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。

9、1mol／LHCl。

10、0.2mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。

12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。

13、0.05mol/LNaOH。

14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

植物组织基因提取

实验步骤：

1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。

3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液［提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6、用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7、然后加入0.5ml左右的10 SSC，使最终浓度为1 SSC。

8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。

10、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。

11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

细菌DNA的提取方法

较为常用的细菌DNA提取方法：

1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

2、取1.5ml培养物12000rpm离心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.

4、加入100ul5mol/LNaCl充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．

真菌DNA提取的方法：

1、真菌菌丝0.5-1g在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min期间混匀2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10000rpm，4℃离心5min）。

5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇混匀静置约30min。

6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀用75%乙醇反复漂洗数次再用无水乙醇漂洗1次吹干，重悬于500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。

8、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10000rpm，离心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc2.5V体积的无水乙醇-70℃沉淀30min以上。

10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

关于基因组提取的一些补充资料

了解你的实验样品
 
    如果你研究某个实验样品，并且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：该样品的核酸含量、酶含量、特殊杂质含量。如果你对样品的特点一无所知，当样品稍微有一点复杂时，抽提核酸的实验就会碰到许多问题。以血液为例，如果你不知道鸟的血液中有核细胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一样的起始量去抽提鸟血的基因组 DNA，怎么可能成功？失败了又怎么知道原因所在？同时，只有对实验样品有所了解，才能正确选择裂解方法。
    绝大部分情况下，使用新鲜样品可以获得最好的结果。对一些杂质含量高的样品，如果使用新鲜样品抽提基因组 DNA 是碰到杂质残留过大的问题，可以试一下 -20C 保存一天后再抽提的对策，可能会有意想不到的效果。样品如果因为某些原因必须先行保存，也要先简化一下样品：血液最好只保存有核细胞；将样品分割后保存，避免反复冻融。如果实验室不具备合适的保存条件，将样品先裂解后再保存，是一个不错的选择。

关于裂解

高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法，是抽提 RNA 的首选。总 RNA 的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组 DNA 相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质 “缠”住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的 RNA 酶，从而确保了 RNA 的完整性。除了极少量不适用该方法的样品 – 主要是植物，其它绝大部分样品的 RNA 的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。该方法也可用于基因组 DNA 抽提，非常快速简单，但纯度不是很高。

SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点。控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。蛋白质的沉淀效率在 4C 会更好一些，所以，加入溶液 III 后在 4C 静置一段时间以及采用 4C 离心去蛋白质，都可以提高质量。该方法不一定要使用 PC 纯化，但结合 PC 纯化，可以获得纯度很高的质粒。RNA 的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100ug/ml) 或者在最后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml) 来实现。总的感觉是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的残留少一些。不过，经典沉淀几乎没有办法彻底去除 RNA 残留。另外，对大质粒 (50 kb 以上)，该方法可能会有问题。

含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法。该方法成功与否与两个因素有关：一是 CTAB 的质量，二是洗涤的彻底程度。CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响，而且，似乎还说不清楚原因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的 CTAB，批号不同，效果就可能差别很大。洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些，同时， CTAB 的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。裂解时的温度，多使用 65C；但如果发现降解严重或者得率太低，可以试一下 37C – 45C 这个相对低温的区域。

核酸醇的沉淀

醇的沉淀，目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质 – 主要是盐 – 的分离。实际操作中，许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来，尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。醇的沉淀并不是非常特异性的，任何有机大分子及一些盐，当浓度达到一定水平后，都可能同步被沉淀下来。

      就核酸而言，标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量，但这决不是说这些盐是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。实际操作中不难发现，当裂解体系中核酸的浓度达到一定水平后，即使体系中不含教科书中建议的盐，单独使用醇也可以使核酸沉淀下来；或者含有盐，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下来 (当然，得率可能会降低)。知道这一点的意义在于：不要迷信标准方法的唯一性；相反，当使用标准方法碰到问题 – 主要是纯度问题 – 时，完全可以通过调整沉淀条件来改善。最有参考价值的是 TRIzol 提供的一个沉淀方案：一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留。另外一个问题就是，要坚信核酸的醇沉淀过程同样也是其它杂质的沉淀过程；调整醇沉淀的条件，虽然会降低核酸的得率，但因为可以大大提高纯度。

      如果核酸抽提的起始样品是比较“脏”的，原则上不要使用低温沉淀。低温沉淀能提高沉淀效率：当核酸浓度很低时，效果明显；当核酸浓度比较高时，效果不明显，但却会导致杂质的大大增加。

    醇沉淀使用异丙醇还是乙醇，我没有发现这二者对质量有大的影响，虽然许多人“发现”乙醇沉淀的核酸纯度更高。异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，帖壁紧，颜色不是很白；乙醇沉淀的核酸比较蓬松，容易从壁上移动，颜色比较白。这是现象，提示结论：异丙醇沉淀的核酸不容易丢掉，但比较难洗涤。结合丢失和洗涤两个方面综合考虑，则建议：少量核酸用异丙醇沉淀 (量少，洗涤不是问题，不丢失为先)，大量核酸用乙醇沉淀 (量大，丢失不是问题，洗涤方便为先)。至于异丙醇沉淀更容易沉淀下盐的说法，我没有碰到过 (我几乎不使用低温沉淀，难道低温沉淀比较容易出现盐沉淀？)；我更觉得出现该现象的原因就在洗涤的不彻底。

    当然，也不要忘记异丙醇沉淀的最大优点是体积小，可以使绝大部分的小量抽提操作在 1.5ml 离心管内完成。但由于其沉淀物很紧凑，洗涤时其中心部分不容易被洗涤到，所以，洗涤异丙醇沉淀的核酸的关键是：一定要使沉淀悬浮起来，一定要放置一段时间使沉淀最终变成蓬松的白色。如果再洗涤一次，质量决不会有问题的。

  PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。虽然它们远没有醇沉淀的高使用频率，但却各有特点。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸沉淀下来。PEG 是沉淀病毒颗粒的方便手段。