欧洲药典4.6 硫酸粘杆菌素
01/2004:0320
硫酸粘杆菌素
DAB:2,4-二氨基丁酸
定义
硫酸粘杆菌素是一种多肽硫酸盐,产生于芽孢杆菌粘杆菌素菌种或用其他的方法获得。
包括:
—— 粘杆菌素E1,E2,E3,E1-I和E1-7MOA的总含量:≥77.0%(干基)
—— 粘杆菌素E1-I:≤10.0%(干基)
—— 粘杆菌素E1-7MOA:≤10.0%(干基)
—— 粘杆菌素E3: ≤10.0%(干基)
性状
外观:白色或类白色粉末,具有吸湿性。
溶解性:溶于水,微溶于乙醇,几乎不溶于丙酮。
鉴别
第一种鉴别方法:B,E
第二种鉴别方法:A,C,D,E
A. 薄层色谱法(2.2.27)
测试溶液的制备:取5mg测试品,加入1ml盐酸和水(1:1)的混合溶液溶解,将溶液置于密封的试管中,加热到135℃,保持5小时。放在水浴上蒸干,继续加热直至湿润的蓝色石蕊试纸不变红为止。在0.5ml水中溶解残渣。
对照品溶液(a)的制备:取20mg亮氨酸,用水溶解,然后用相同的溶剂稀释到10ml。
对照品溶液(b)的制备:取20mg苏氨酸,用水溶解,然后用相同的溶剂稀释到10ml。 1/5
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对照品溶液(c)的制备:取20mg苯丙氨酸,用水溶解,然后用相同的溶剂稀释到10ml。
对照品溶液(d)的制备:取20mg丝氨酸,用水溶解,然后用相同的溶剂
稀释到10ml。
薄层板:TLC硅胶G板
流动相:水-苯酚(25:75 )
在避光条件下进行如下操作:
进样量:在10mm 谱带中点5µl。
预处理:将薄层板放在色谱柱中,这样它不会与流动相接触,密封柱盖,使薄层板在流动相的蒸汽中浸润至少12小时。
展开长度:超过12cm
干燥:在100-105℃ 的条件下干燥。
检测方法:向薄层板喷射茚三酮溶液,然后在110℃下加热5分钟。
检测结果:用测试品溶液得到的主要斑点和用对照品溶液(a)和(b)得到的主要斑点在位置、颜色和尺寸上相似,但是和用对照品溶液(c)和(d)得到的主要斑点不一致。用测试品溶液得到的色谱也显示一个非常低的Rf值(2,4-二氨基丁酸)。
B. 检查含量检测的色谱图
结果:在测试品溶液得到的HPLC色谱图中,粘杆菌素E1和E2的峰在残留时间上和用对照品溶液(a)得到的峰一致。
C. 取约5mg测试品,用3ml水溶解。加入3ml稀释的氢氧化钠溶液。摇动,加入0.5ml 10g/l的硫酸铜溶液,溶液应显紫色。
D. 取约50mg测试品,用1ml 1M盐酸溶解,然后加入0.5ml 0.01M碘,溶液保持有色的。
E. 呈硫酸盐(2.3.1)反应(a)。
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检查
PH(2.2.3):4.0-6.0
取0.1g测试品,用不含CO2的水溶解,然后用相同溶剂稀释到10ml。
比旋光度(2.2.7): -63°到-73°(干基)
取1.25g测试品,用水溶解,然后用相同溶剂稀释到25.0ml。
相关物质:
液相色谱法(2.2.29):用归一化法。
测试溶液:取25.0mg测试品,用40ml水溶解,然后用乙腈稀释到50.0ml。
对照品溶液(a):取25.0mg硫酸粘杆菌素标准品,用40ml 水溶解,然后用乙腈稀释到50.0ml。
对照品溶液(b):用乙腈-水(20:80)的混合溶液100ml将1.0ml对照品溶液(a)稀释到100.0ml 。
色谱柱:
--- 尺寸:长度= 0.15m, 直径=4.6mm
--- 固定相:色谱用封端十八碳烷基硅胶柱(3.5µm)
--- 柱温:30℃
流动相:将22倍体积的乙腈和78倍体积按下述方法制备的溶
液相混合:取4.46g无水硫酸钠,用900ml水溶解,加入2.5ml磷酸,用水稀释到1000ml(PH2.3 ~2.5)
流速:1.0ml/min
检测:用分光光度计在215nm处检测。
进样量:20µl
运行时间:粘杆菌素E1 保留时间的1.5倍。
和粘杆菌素E1相比的相对保留时间(保留时间=约16分钟):
粘杆菌素E2= 约 0.45; 粘杆菌素E3=约0.5; 粘杆菌素E1-1=约0.8; 粘杆菌素E1-7MOA= 约1.1.
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系统适用性实验:
对照品溶液(a)
--- 分离度:粘杆菌素E2和粘杆菌素E1峰之间的分离度最小为8.0,粘杆菌素E2和粘杆菌素E1-I峰之间的分离度最小为6.0,粘杆菌素E1-I和粘杆菌素E1
峰之间的分离度最小为2.5,粘杆菌素E1和粘杆菌素E1-7MOA峰之间的分离度
最小为1.5。
--- 用对照品溶液(a)所得到的色谱图和用硫酸粘杆菌素标准品得到的色谱图是一致的。
限量:
--- 任一杂质:≤4.0%
--- 总杂质:≤23.0%
--- 可忽略不计的杂质:在用对照品溶液(b)得到的色谱图中,粘杆菌素E1的峰面积,粘杆菌素E2,E3,E1-I,E1和E1-7MOA的峰可以忽略不计。
硫酸盐:16.0%~18.0%(干基)
取0.250g测试品,用100ml水溶解,然后用浓氨水将溶液的PH值调节为11。加入10.0ml 0.1M 氯化钡和约0.5mg 邻甲酚酞络合剂。用0.1M依地酸钠盐滴定,当溶液颜色开始变化的时候加入50ml乙醇,并继续滴定直到蓝紫色消失为止。
1ml 0.1M 氯化钡相当于9.606mg SO4。
干燥失重(2.2.32): ≤3.5%,取1.000g测试品,在60℃温度和不超过670Pa的压力条件下用P2O5干燥3小时。
硫酸盐灰份(2.4.14):≤1.0% ,用1.0g测试品进行检测。
含量
除了下列内容有变化以外,含量的检测方法和检测相关物质的
液相色谱法(2.2.29)都相同: 4/5
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进样:测试品溶液和对照品溶液(a)。
用对照品溶液(a)得到的色谱图和硫酸粘杆菌素标准品的含量来计算粘杆菌素E2,E3,E1-I,E1和E1-7MOA的总含量和粘杆菌素E1-I和E1-7MOA的百分比含量。
贮藏
密闭容器中,避光。
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