主题：【资料】化学分析样品制备(86讲 待续)

化学分析样品制备（2）



第一章  样品制备的基础知识（2）


常用的分析仪器列于 表 1-1中。样品的制备决定于所使用的分析技术，和它的容量，例如：只有几微升的样品可以注射到气相色谱仪中，所以分析鱼肝中农药的样品，其制备出来的样品溶液，最后只能往气相色谱仪注射几个微升的样品。

    取样、样品保存、和样品制备等步骤全是为了这几个微升具有代表鱼肝中农药的试样，显然这三个步骤如果除了问题，任何好的仪器也无法补救，所以样品的前处理尤其是样品制备是不可忽视的程序。



表 1-1 常用的仪器分析方法和在进行分析以前必需的样品制备步骤



GC=气相色谱，HPLC=液相色谱，MS=质谱，AA=原子吸收光谱，GFAA=石墨炉原子吸收光谱，ICP=电感偶合等离子光谱，UV-VIS=紫外可见分子吸收光谱，IC=离子色谱



1.1.1  定性和定量分析



对一个分析任务不可能只有一种分析测试方法，即使是一个很确定的分析也不只有一种解决方法，各种研究有不同的目的和一定的经济条件限制，具有不同经验的人员会采取各自的途径，在方法设计中最为重要的是要达到研究的目的，至少要得到应有的最后结果，这一结果的数据能提供有用的信息，可解决要解决的问题。

分析测试的目的可以是定性分析或定量分析，例如，要了解鱼肉中的农药残留，要回答的问题可以是：在鱼肉中有没有农药残留？如果有是什么农药？这一问题的回答是定性分析的任务，那么分析化学家要筛查鱼肉中存在什么农药。下一个问题是在鱼肉中有多大浓度的农药？这是一个定量分析的任务，即不仅是回答存在不存在农药，还要回答存在农药的浓度。另外一个任务是半定量分析，它不需要知道确切的数量，而是要知道高于或低于某一水平的阈值。前列腺特异免疫抗原（PSA）的测试就是一个例子，它是为了筛查前列腺癌为目的，PSA 值为 4 ng/L (或高于此值)说明具有较高前列腺癌的可能性，这一检测项目的任务是高于或低于4 ng/L 。

一旦分析目标和对象确定了，就要考察所用分析方法，注意力集中到方法的准确度、精密度、费用、以及其他限制性因素，完成分析所需的人力和时间，是否可以自动化等也是很重要的。



（资料来源：“Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry“，Editor J. D. WINEFORDNER，2003）

            学分析样品制备（5）



第一章  样品制备的基础知识（5）



分析科学中选用相对标准偏差表示精密度的参数，在样品制备中精密度特别重要，变异性也能影响准确性，大家都知道，分析的重复性的下降是随浓度不成比例降低的，典型的关系如图 1-4 所示。它说明在痕量分析中不确定度比之常量和低含量分析要以指数方式增加，如果样品制备的步骤加进去附加的偏差会增加到这一曲线里，有把握地设想，在样品制备中其不确定度也会随浓度的降低而增加。一般来说仪器越来越精密，提供更为精密和准确的数据，可是另一方面样品制备就要求更苛刻了，它会对不确定度有更大的影响。再回到测定鱼中的农药残留的问题，最终测定要用计算机控制的气相色谱-质谱（GC-MS）方法进行分析，而样品制备包括在研钵中把肝研磨混匀，然后用索氏萃取器进行溶剂萃取、浓缩、净化，样品制备几乎要用一天的时间，而GC-MS也就是几分钟的事。样品制备包括几个不连续的步骤，有手动的操作，所以样品制备比起测定来讲其系统误差和随机误差都要大。




样品制备对误差的相对影响决定于测量过程中它的步骤，例如，典型情况下在色谱分析过程中有三分之二是消耗在样品制备上，例如用液相色谱质谱（HPLC-MS）测定血浆中的抗精神病药奥氮平，可以说明这一情况，其中把样品和内标进行混合，然后用一支固相萃取（SPE）小柱进行样品净化，使用标准曲线进行定量分析，在这一方法中回收率为 67±4%，而十次重复测量的重复只有 1% 到 2%，详细的误差分析说明这一分析的不确定度有 75% 来源于样品制备过程。其余的不确定度来源于分析步骤，在分析不确定度中的 24% 的不确定度来源于校准，1% 来源于血清样品体积的变动，值得注意的是改进校准过程的测量要比改进 SPE 操作简单的多，在 SPE 中的变动性来源于小柱子本身、洗涤、萃取、干燥、或再溶解的步骤，具有很多的变动性要控制。

下面讨论在样品制备中减小不确定度的有用方法。



（资料来源：“Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry“，Editor J. D. WINEFORDNER，2003）

化学分析样品制备（6）



第一章  样品制备的基础知识（6）



尽可能减少操作步骤

在上面的例子里，样品制备带来 75% 的误差，像图 1-2 所示那样有许多样品制备的操作步骤，就会把各个步骤的不确定度加在一起，在图 1-5 中表示一个简单的例子，把溶液稀释 1000 倍可以一步完成，即取 1 mL 稀释到1000 mL，也可以分三次完成，每一次稀释到 1：10，一次稀释包括移液管和容量瓶体积的不确定度，而三次稀释则包括三个移液管和三个容量瓶体积的不确定度，这样体积的不确定度就叠加多次。严格的分析说明，一次稀释只有三次稀释不确定度的一半。



如果有可能避免进行多次样品处理，处理的步骤越多带来的误差越大，例如使用选择性强的萃取方法就可以避免样品的净化。



选择适当的方法

已经知道有些方法其变动性要大于其他的方法，在开始的时候就要选择适当的方法以便提高精密度，例如，在体积小于 20 mL 时使用注射器的精密度和准确度高与移液管，大体积有利于精确操作，但是会造成稀释降低灵敏度，要选择样品制备和分析仪器相结合的方法，这样一来会减少样品制备步骤以及降低 RSD ，自动化操作有利于提高精密度。



（资料来源：“Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry“，Editor J. D. WINEFORDNER，2003）

化学分析样品制备（８）
            第一章  样品制备的基础知识（８）
方法的执行和方法的确认
    用于评估分析方法的标准的参数叫做优良数值（figure of merit），基于这一特征值人们可以预估什么样的方法可以适合某种应用的需要，表 1-2 列出优良数值，准确度和精密度已经讨论过，其他重要的特征值有灵敏度、检测限、定量范围。

表 1-2 仪器或分析方法的优良数值


1-3-1 灵敏度

    一个方法（或仪器）的灵敏度是在指定置信水平下它分辨低浓度之间差别能力的度量。最简单测量灵敏度的方法是计算在有关浓度范围内校准曲线的斜率，它叫做校准灵敏度（calibration sensitivity），通常仪器的校准曲线是线性的，可以用下面的公式得到：
式中 S 是在浓度为 c的信号值，Sbl 是空白值（即没有样品时的信号），m 是校准曲线的斜率。当有样品制备的程序时，必须把这一步骤的影响加到回收率当中，例如：用萃取制备样品时，只有一个萃取效率 r 的比例分数影响分析，那么 1-11 式就变成
现在的灵敏度是 mr 而不是 m ,回收率越高灵敏度就越高，回收率接近于100% 可保证达到最高的灵敏度。空白值也会影响样品的制备步骤，，Sb  空白值来源于样品制备和分析全过程。
    因为精密度在低浓度时会下降，辨别低浓度之间差别的能力也下降，所以作为精密度函数的灵敏度用分析灵敏度（analytical sensitivity）来表示，如下面的公式[4]。
式中档 Ss 基于样品制备和分析所带来的标准偏差，由于它与Ss 有关，所以分析灵敏度随浓度而改变。

（资料来源：“Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry“，Editor J. D. WINEFORDNER，2003）

          化学分析样品制备（９）

            第一章  样品制备的基础知识（９）


  1.3.3 定量分析的范围

  可在最低浓度下进行定量分析的浓度叫做定量限[limit of quantitation (LOQ)]，LOQ 经常定义为十倍的信/噪比，如果噪音大约为空白值的标准偏差。LOQ 就是 (10 ×Stb1),再者，当把样品制备步骤的回收率考虑在内的话，方法总的 LOQ 要增加，乘以1/r 。
从实际情况出发，定量分析的上限要确定，即校准曲线成非线性的那一点，这一点叫做线性限[ Limit of linearity (LOL)]，可一从图 1.3 看出。希望分析方法的线性动态范围 [（linear dynamic range (LDR)）至少有两个数量级，当然比此值小一些也可以。
考虑到上述这些因素，在样品制备中的回收率是十分重要的参数，它会影响定量结果，诸如检测限、灵敏度、LOQ、甚至 LOL 。样品制备技术提高会造成其回收率（r）大于 1 的结果，这样就会提高灵敏度、降低检测限。

            化学分析样品制备（１０）

            第一章  样品制备的基础知识（１０）


1.3.4 其他重要参数
    有一些影响仪器和测定程序选择的重要因素，这些参数是表1.2 中的 7～13。这些参数对样品制备的影响比分析本身更为重要，如前所述，与分析本身比较样品制备经常是分析的瓶颈，样品制备一般要慢一些，所以测定速度和样品通量决定于样品制备步骤的缩减。现代的分析仪器趋于使用自动进样器、自动样品制备器和自动控制/数据采集而高度的自动化，另一方面许多样品制备方法不断需要费时费力，需要手工操作，这样就会拖长分析时间并会引入随机和系统误差。

表1.2 中的 7～13

化学分析样品制备（11）

第一章  样品制备的基础知识（11）

1.3.5 方法的确认

    在要执行一个新的分析方法或一个样品制备技术前，必须进行确认性的研究，在进行确认时要对各种有影响的条件进行测定，测量影响准确度和精密度的随机和系统误差，对每一个被分析的样品要确定其检测限，在方法要求的浓度范围内测定其准确度和精密度，确定动态线性范围和校准灵敏度。一般上，方法的确认要对新方法的优越性进行全面的描述，并对已有的方法进行比较提供根据，一个典型的确认过程包括一个或多个下面的步骤：
*  单一操作员贡献值（single operator figures of merit）。测定准确度，精密度，检测限，线性动态范围，和灵敏度
*  未知样品分析。这一步包括未知浓度样品的分析，定性和定量分析都需要进行，可靠的未知样品来自于商品或政府机构，它们是有证书的参考物质，测定它的准确度和精密度。
*  等效测试  一个方法一经开发出来，一定要和已经有的方法进行对比，进行统计分析用以确定是否已建立的新方法可以给出相同的结果来，典型的统计分析包括用于平均值比较的学生检验，和用于偏差比较的 F-检验。
*  协作测试  一个方法一经在一个实验室进行了确认，这一方法就要进行协作测试，这里要在各个实验室使用同样的样品和操作规程，对所得结果进行统计分析，确定偏差和实验室之间的变动性，这一步骤确定方法的耐用性（ruggedness）.

    方法的确认决定于分析的目的，例如，对 PCR建议确认的步骤要遵从重组 DNA 测定的凝胶电泳的方法，包括以下的步骤：
1．比较在相似的条件下多次（比如 6 次）单独分析参考标准样品的精密度。
2．分析数据的变异系数必须小于某一定值（比如 10%）。
3. 方法的确认应该分三天进行，在同样的条件下对标准样品做三次重复分析，比较其精密度（再一次接受这一方法的判据就是要符合规定的相对标准偏差）。
4．为了证明这一点，让另外一个分析人员进行这一实验，得到类似的精密度，两个分析人员应当分别独立地进行测量（再接受这一方法的判据就是要符合规定的相对标准偏差RSD）。
5．必须用系列稀释的样品测试检测限、定量限、和动态线性范围，建议在每一个浓度下重复进行三次试验，校准曲线可以接受的标准是达到规定的相关系数（即r2值要等于或大于0.995）
6．分子量标记物必须落到已经建立的迁移时间范围内，分子量标记物落到迁移时间范围以外，必须重复进行凝胶电泳试验。

（资料来源：“Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry“，Editor J. D. WINEFORDNER，2003）

化学分析样品制备（12）

    第一章  样品制备的基础知识（12）

1．4 样品的保存
    样品必须满足研究要求的条件下进行保存，样品在采集以后受物理、化学、和生物过程的影响会改变样品的组成，物理过程如蒸发、扩散、在表面上吸附使样品变化，可能的化学变化有光化学反应、氧化和沉淀，生物过程包括生物降解和酶反应。而且样品降解在痕迹量分析的低浓度时尤为突出。
    收集到的样品处于和原有条件不同的情况下，例如分析样品是地下水，它从来没有暴露在光下，所以当它处于太阳光下时就会受到显著的光化学反应。不可能长久地保持样品的完整性。使用的保存方法至少可以在分析前保持样品的成分不变。实际的方法是在样品不会降解的时间范围内完成样品的分析。表 1-3 列出一些典型保存样品的方法。

    表 1-3  样品保存的方法（1）