主题：【资料】气相色谱手性分离(71讲 待续)

气相色谱手性分离 (61)

    环糊精衍生物做气相色谱手性固定相（31）
全甲基-O-((S)-2-羟丙基)-环糊精的分离性能（7）

  从前面几讲列出的有关全甲基-O-((S)-2-羟丙基)-α-，β-，和γ环糊精的分离数据可以看出，这一手性固定相扩大了CD衍生物手性固定相应用范围，可以分离更多的手性对映体，它们对脂肪胺、环氧化合物、大环醚、内酯、氨基醇、以及饱和的双环化合物对映体具有很高的选择性，如图61（1，2，3，4）所示。




图 61-1在9米长（0.25 mm i.d.）涂渍全甲基-O-((S)-2-羟丙基)-β-环糊精石英毛细管柱上分离内酯类对映体的色谱图，柱温在60℃下保持10min，然后以3℃/min的速度升温到70℃，载气为氮。
    图 61-2在9米长涂渍全甲基-O-((S)-2-羟丙基)-β-环糊精石英毛细管柱上分离桥环化合物类对映体的色谱图，柱温在90℃，载气为氮。
    图 61-3在20米长涂渍全甲基-O-((S)-2-羟丙基)-β-环糊精石英毛细管柱上分离呋喃和吡喃类化合物类对映体的色谱图，柱温在50℃，载气为氮。
    图 61-4在15米长涂渍全甲基-O-((S)-2-羟丙基)-β-环糊精石英毛细管柱上分离胺类化合物类对映体的色谱图，柱温在70℃下保持1510min，然后以2℃/min的速度升温到90℃，载气为氮。
    内酯是不对称合成中很重要的中间体，分离它们的对映体很有意义，如图61-1所示。




（资料来源：D.W.Armstrong ,et al., Anal Chem. 1990,62(9):914～923）

气相色谱手性分离 (62)
    环糊精衍生物做气相色谱手性固定相（32）

全甲基-O-((S)-2-羟丙基)-环糊精的分离特点和机理（1）

    使用环糊精固定相色谱柱（或者使用环糊精做流动相添加剂）的反相液相色谱，其手性分离主要依靠形成包含化合物，在气相色谱中是否也是这样[1，2]，形成包含化合物在很大的程度上取决于被包含分子的尺寸和形状，因此，α-，β-，γ-环糊精的内腔直径不同，相对于被包含分子的匹配程度不同，对形成包含化合物有很大的影响，对每一种环糊精来说，是否适应被包含分子的几何结构也有很大的影响。一般来说溶质对环糊精的显著的尺寸和形状选择性（它和热力学结合常数相一致）作为形成包含化合物的依据，这一情况在使用环糊精固定相和气相色谱中都是这样[3，4]。尽管这一情况不是十分明确，但是也出现在亲脂性α-，β-，γ-环糊精固定相（例如二苯基、三苯基、戊基和乙酰基环糊精固定相）选择性当中。在目前使用的亲水性 PMHP-CD 固定相上，不同尺寸外消旋化合物几乎没有明显的选择性差别，所有的化合物在大的PBHP-γ-环糊精固定相上分离能力比较小，而在α-，β-PMHP-CD 固定相上却可以很容易地分离开（见上几讲中的表中数据），类似情况，许多外消旋化合物在α-PMHP-CD 固定相上分离因子并不小（反而常常更大一些），比在β-PMHP-CD 固定相上还要大一些。
    这种特殊环糊精衍生物的特点是其取代基是手性基团（即羟丙基），为了要评价这一基团（因为它影响手性选择性）的作用合成了全甲基-（R）-羟丙基取代β-环糊精，使用了几种手性化合物作溶质进行分离，把这些化合物的R和S对映体进行分离和表征，确定了这些化合物（如(2,2-二甲基-1,3-二氧-4-基)甲醇，1-环己基乙胺，1-（1-萘基）-乙胺等）的流出次序，所有这些化合物都可以在（S）-羟丙基取代β-环糊精柱上，或者（R）-羟丙基取代β-环糊精柱上得到分离。

(1) Konig, W. A.; Lutz, S.; Mlschnik-Lublecke, P.; Brassat, B.; Wenz, G. J.Chromatogr. 1988, 447, 193.
(2) Konig, W. A.; Lutz, S.; Wenz, G.; von der Bey, E. HRC CC. J . HighResolut. Chromatogr. Chromatogr. Commun. 1988, 1 1 , 506.
(3) Smolkova-Keulemansova, E. J. Chromatogr. 1982, 251, 17.
(4) Smolkova-Keulemensova, E.; Kralova, H.; Krysl, S.; Feltl, L. J. Chromarogr.
1982, 241, 3.

气相色谱手性分离 (63)
    环糊精衍生物做气相色谱手性固定相（33）

全甲基-O-((S)-2-羟丙基)-环糊精的分离特点和机理（2）

    上一讲提到合成了全甲基-（R）-羟丙基取代β-环糊精，使用了几种手性化合物作溶质进行分离，把这些化合物的R和S对映体进行分离和表征，把这两个色谱柱上的得到分离数据进行比较，其结果意想不到，被测定的任何样品没有对映体的分离次序的逆转，而且所有的对映体的分离因子和分离度和在全甲基（R）-羟丙基及（S）-羟丙基衍生物色谱柱上的数据相同，在上面几讲（56～58讲）表中展示过的其他15个外消旋对映体在两种β-环糊精衍生物柱上分离情况没有规律性，在选分离因子或分离度上没有任何明显的差别。因此可以看出羟并丙基取代基的构型对所研究的化合物的分子识别中没有什么大的作用，而还是环糊糊精母体起着重要的作用。目前还不知道这一现象是否典型，或者可能只是受到所测试化合物的局限性。
许多环糊精络合物在水溶液或亲水性有机溶液中，在60～90℃之间会遭到破坏，但是可以在GC固定相中于200℃以上的温度下进行手性分离，大家知道增加柱温会使色谱峰流出加快，两个峰会靠近，温度再高一些两个峰就合在一起了。每一个外消旋混合物在给定的色谱柱上有一个特征的温度，高于这个温度就没有手性选择性了。在GC中没有竞争性溶剂分子，无疑这是GC的优点，这一优势会由于提高温度而加强。更为重要的是手性选择色谱需要同时有多个相互作用力，溶剂会完成或干扰这一过程。似乎有这样的情况，具有较少官能团的手性溶质就是由于流动相中没有竞争性组分可以在GC中得到分离，因此相对较小作用的手性作用力（如色散力）在GC中很重要，但是在HPLC中不是这样。在HPLC中流动相/固定相或溶质/溶剂之间的作用力起主导作用。
    但是在全甲基-（R）-羟丙基取代β-环糊精柱上是否形成络合物还不得而知，显然全甲基-（R）-羟丙基取代β-环糊精柱上形成包含化合物的证据要比其他环糊精衍生物固定相还要少。从理论上讲环糊精（作为一个手性分子）应该和吸附在它外表面或圆台的顶部或底部的分子产生手性相互作用，当形成强烈的手性作用时由于在固定相中传质阻力增加，使峰加宽，但是这不会成为这类手性固定相分离的问题。我们猜想这类手性固定相没有强烈的包含化合物（即溶质分子没有钻入环糊精的洞穴中）形成，只形成松散的不完全的包含化合物的结合。
（资料来源：D.W.Armstrong ,et al., Anal Chem. 1990,62(9):914～923）

气相色谱手性分离 (64)
                      气相色谱手性柱的应用（1）

    对映体气相色谱分离中有色散力、静电力、诱导力和超分子作用力（如形成包含化合物）影响对映体的分离，而且形成包含化合物对手性化合物的分离起着重要作用，所以环糊精衍生物手性毛细管柱近年得到广泛的应用。
    昆虫信息素对昆虫的定向、召唤、交尾、产卵、聚集、追踪、告警、防御以及种间识别等行为均具有重要的作用。昆虫聚集信息素(aggregation pheromone) 通常被定义为由昆虫产生, 并能引起雌、雄两性同种昆虫聚集行为反应的化学物质。昆虫通过聚集或获得有益的环境, 或共享资源, 或抵御外敌的侵袭。昆虫聚集信息素是昆虫重要的信息化学物质之一,对昆虫的聚集行为有重要意义.近三十年来,国外鉴定了多种昆虫聚集信息素,主要成分为一些烃、醇、醛、酮、酯、酸、酸酐、胺以及腈类化合物,昆虫信息素的手性混合物多为小分子，多使用手性毛细管色谱柱进行分离，例如澳大利亚香蕉象鼻虫聚集信息素是(1S, 3R, 5R, 7S)-1-乙基-3, 5, 7-三甲基-2, 9-二氧双环[3.2.1]辛烷 ( 13) 和它的 (7R)-差向异构体（14）（下图），这两个对映体可以使用全甲基 β-环糊精色谱柱进行分离。


与上述情况类似，橡皮甲虫聚集信息素齿小蠹烯醇和齿小蠹二烯醇的对映体也可以用β-环糊精衍生物色谱柱进行分离。如图64-2表是合成的齿小蠹烯醇和齿小蠹二烯醇对映体（上面）和昆虫产生的（下面）聚集信息素的分离图。


图 64-2  橡皮甲虫聚集信息素齿小蠹烯醇和齿小蠹二烯醇    的对映体分离
（来源：Graeme R. Jonesa, Neil J. Oldhamb,，J.Chromatogr.A, 1999, 843199–236）

气相色谱手性分离 (65)
            气相色谱手性柱的应用（2）---
          在精油和调味品中的应用（1）

      使用环糊精衍生物固定相的气相色谱柱目前普遍用于直接测定可挥发性外消旋混合物的对映体，在精油、香料和调味品中有很多应用。因为CD 柱稳定、重复性好，这一方法大多不要衍生化，分析直接，快速，而对这一类产品测定其对映体过剩值（ee值）或对映体比（ER）十分重要，不仅可以表征蔬菜基体或萃取物的特点，可以评价它一种或多种化合物的生物合成途径，而且还可以确定其出产地，以及鉴定它的真伪。
    CD 柱的出现大大促进了精油的发展，这类化合物的结构如图 65-1所示


图 65-1 精油类化合物的结构
        1—α-蒎烯，2—β-蒎烯，3—柠檬烯，4—薄荷酮，
        5—异薄荷酮，6—薄荷醇，7—异薄荷醇，
        8—胡薄荷酮，9—薄荷基乙酸酯，10—桧烯，
        11—里哪醇。12—萜品醇，13—萜品烯-4-醇





图 65-2 使用 30% 2,3-DiMeTBS-b-CD/PS-086)色谱柱分离标准物（a）和薄荷油（c）的色谱


文献来源于：
C. Bicchi, A. D’Amato, V. Manzin, P. Rubiolo, Cyclodextrin Derivatives in gc Separation of Racemic Mixtures of Volatiles. Part XI. Some Applications of Cyclodextrin Derivatives in gc Enantioseparations of Essential Oil Components
Flavour Fragr. J. 1997，12：55-61.

气相色谱手性分离 (66)
    气相色谱手性柱的应用（3）---在精油中的应用（2）

    桔子油广泛用于食品中，称做“商品桔油”的产品一般含有桔萜、γ-萜品烯、N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯、麝香草酚等和一些少量天然桔子油混合而成，这种产品的价格低于真正桔子油，但是它的香气质量远低于天然桔油。在20℃时天然桔油的旋光度从+65°～75°之间，而甜桔油及其萜烯类的旋光度从+98°～100°之间，为了使配制桔油的旋光度降低，在12～16%市售产品中均加有大量（1）-苧烯。在天然桔油中加入了这些配制油，从而改变了两种苧烯对映体的比例，要测定两种苧烯对映体的比例就可以检测桔油被搀假。
    使用串联色谱柱（SE-54柱+β-环糊精柱）可以分离检测桔油的真伪。

串联色谱柱：1. SE-54 毛细管柱（25m×0.32mm×0.4mμ）
        2. （2,3,6-三-O-甲基）-β-环糊精-OV-1701(30%比70%)柱(25m×0.25mm×0.25mμ）
柱温：从 80℃以1.2℃/min 程序升温到105℃
进样口温度：250℃
载气：氢气
分流进样：分流比 1：100
结果如下图和表66-1所示:






文献来源：J.Essential Oil Res.1992,4(6):589-594,译文：丁德生

气相色谱手性分离 (67)
  气相色谱手性柱的应用（3）——药物对映体的分离测定

    美芬妥英(mephenytoin, MP) 是乙内酰脲类抗癫痫药, 因长期用药可引起严重的药物不良反应, MP 是由S-美芬妥英(S-M P) 和R-美芬妥英(R-M P) 两种对映体组成的混旋体。近年采用GC-NPD 或GC-MS方法测定服药后0～8h 和8～24h 尿样中S-MP 和R-MP 对映体的含量, 求其S/R 比值以反映个体羟化代谢能力[5 ]; 但是, 现有的GC-NPD 或GC-MS 方法存在分析时间长和分离不完全等缺点。这里介绍的方法具有快速、简便、灵敏和准确等优点, 已广泛用于不同个体间或种族间美芬妥英代谢能力和CYP2C19 酶活性的研究。

气相色谱条件：色谱柱——手性石英毛细管柱(Ch irasil-Val, 25m×0.25mm , Alltech 产品。
标准溶液的配制：精确称取一定量S-MP 和R-MP, 用50% 甲醇水配成单标储备液(015g/L ),用尿稀释储备液配成工作液(50mg/L )。标准溶液在- 20℃ 下冻藏。
分离与检测条件：参考Wedlund 等[1] 方法进行修改, 柱温190℃,进样器220℃,NPD，240℃, 检测器铷电流30pA。高纯氮气流速为0.85mL/min, 高纯氢气和压缩空气的流速分别是3.5 和 120mL/min。
尿样本的制备方法：精确吸取含有不同浓度的标准品的正常人尿样或服药后收集的尿样1mL,分别加入4mL 二氯甲烷, 振荡4min 后离心(3500r/min) 10min;吸取有机相3mL 于另一洁净试管中, 放入37℃ 恒温水浴, 用氮气吹干。残渣用30μL 乙酸乙酯溶解, 取5μL 进样，色谱如图-1所示.


[1] 　W edlund P J , Sweetman B J , M cA llister C B et al . J. Chromatogr. Biomed. Appl., 1984; 307: 121

文献来源：黄松林等，气相色谱法检测人尿中R, S-美芬妥英浓度，色谱，1997，15（5）：408-410

气相色谱手性分离 (68)
气相色谱手性柱的应用（5）——药物前体DL-泛酸内酯对映体的分离测定

        DL-2-羟基-3,3-二甲基-γ-丁内酯,又称DL-泛酸内酯。是由Willtanes从肝脏提取的泛酸(B族维生素的一种)的分解产物中首次发现。它是合成泛酸，D-本多生醇，D-本多生酸钙的重要的中间体，是一种营养剂，广泛用作生物研究。至今为止DL-泛酸内酯的分离及制备多用两种方法：生物手性拆分和不对称合成，这一方法是首次使用毛细管气相色谱桥联环糊精柱进行手性分离的方法。DL-泛酸内酯的合成及结构如图68-1所示。


    桥联环糊精是通过一定的双功能团桥联试剂将两个环糊精分子键连起来而制得。自从1979年报道第一个桥联试剂以来，对桥联环糊精的合成及应用的研究均有较大的进展，目前已合成各种各样的桥联环糊精。这里利用全甲乙二胺桥联环糊精（如下图）分离DL-泛酸内酯的对映体。


柱尺寸 T/℃ R α
10m×0.25mm 140 0.943 1.09




图 68-2 分离DL-泛酸内酯分离图



资料来源：陶丹妮，史雪岩，顾峻岭，傅若农， Chinese Chem,Letters,  2001，12（5）：447

气相色谱手性分离 (69)

        气相色谱手性柱的应用（6）——
    榛实油中5-甲基-2-庚烯-4-酮对映体的分析

    为了研究不同产地榛实油中（E）-5-甲基-2-庚烯-4-酮（filbertone）对映体的分布，以及研究烘烤前后对映体量的不同，使用固相微萃取（SPME）和手性毛细管柱来分析两种对映体的含量。

材料和方法：

  试验用材料——取不同产地（西班牙，意大利，土耳其，法国，和克罗地亚）的未烘烤榛实油 2 L，烘烤榛实油 2 L。
  SPME——使用Supelco 公司的 SPME 装置，萃取头为 65μm 的聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB），萃取前把萃取头在色谱仪的汽化室中于260℃下老化 30min。
榛实油样品在萃取之前不要做任何预处理，在5mL样品瓶中取 5mL 榛实油样品，用塑料薄膜密封，把SPME萃取头置于样品瓶顶空部位在70℃下暴露5 min，样品要进行搅拌，萃取后把SPME萃取头置于气相色谱仪进样口中于250℃进行热脱附，并进行GC分析。

    GC分析——使用HP公司的 5890 气相色谱仪，分流/不分流进样，FID检测器。载气为氦气，流速为1 mL/min。色谱柱为 25-m×0.25-mm i.d 环糊精手性毛细管柱（Chirasil-β-Dex, Chrompack公司），进样后在起始温度45℃下保持5 min，再以 3℃/min 程序升温下升到 90℃，再以 5℃/min 程序升温下升到 150℃。以纯的  (+)- 和 (-)-对映体对照进行定性分析。分离的色谱图见图69。


资料来源：M. L. RUIZ DEL ｃａｓｔILLO, G. FLORES, M. HERRAIZ, AND G. P. BLANCH
Solid-Phase Microextraction for Studies on the Enantiomeric Composition of Filbertone in Hazelnut Oils，J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 2496-2500

近年国内固相萃取-色谱分析的进展(70) 

      这一讲座是有关近年国内固相萃取-色谱分析的进展的综述报告，它的浓缩性综述论文发表在《分析试验室》, 2007,26(2):100-122上。本讲座是对这一综述的展开性报告的第11部分.——固相萃取-色谱分析在水质分析中的应用（12）
2．固相萃取-色谱分析在水质分析中的应用（见表2-1）

表 2-1  固相萃取-色谱分析在水质分析中的应用2-12