主题：【资料】兴奋剂类分析方法系列讲座(40讲 待续)

兴奋剂类分析方法系列讲座（9)（下）-调查新型毒品滥用情况


2.4  麻谷丸滥用史

初次滥用药物年龄15~50（29.0±s 7.8）a； 30 a以下初始滥用麻谷丸人员占53.2 %，其中20 a%以下年龄者占14.7%。滥用年限1 a以内（ 含1 a） 者占84.4%。详见表3。



3  讨论

20 世纪末，我国出现合成的苯丙胺类物质甲基苯丙胺（俗称冰毒）、3,4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺（ 俗称摇头丸）及氯胺酮（俗称K粉）的滥用问题。这些毒品被称为“新型毒品”，是相对阿片、海洛因、大麻等传统毒品的又一大类滥用物质的称谓。同海洛因等传统毒品相比，此类毒品具有精神依赖性强，身体依赖性相对弱的特点［7］。



麻谷丸的主要成分为甲基苯丙胺和咖啡因，并添加有其他成分的精神活性物质。由于几种精神活性物质的联合作用，其兴奋性、致幻性超过了“ 冰毒”和“摇头丸”的作用，成为吸毒者们的新宠。同时，麻谷丸对人体的毒性和成瘾性的作用十分强烈，根据中国人民解放军307医院戒毒科的临床病历记载，滥用麻谷丸成瘾者，停止或者减少吸食量时，临床症状表现为：心慌、盗汗、血压增高、情绪抑郁、疲惫及四肢无力、失眠、性欲减退、体重下降、记忆力下降、劳动能力下降、情绪反常，有时出现幻觉。再吸食麻谷丸时上述症状缓解。



2005年，在各地公安部们发布的已破获的毒品案件中，涉及制造、贩卖麻谷丸案件已经遍及我国大陆地区31个省、自治区、直辖市以及香港、澳门特别行政区，其中不乏破获的大案要案。涉毒分子在暴利驱使下，大肆制、贩麻谷丸的犯罪行为，使麻谷丸滥用在全国迅速蔓延。



2005 年涉及麻谷丸滥用者的监测数据分析，对滥用的发生情况、滥用者人口学特征及与滥用麻谷丸有关行为，有以下提示：



（1）全国.40%-以上的省份发现麻谷丸滥用者。2003年至2005年采集的麻谷丸滥用监测报表数量逐年快速递增，涉及的地域由最初的东北地区向华北、华中、华东、华南和西北地区扩展。截止到2005年底，仅西南地区（ 重庆市、四川省、贵州省、云南省、西藏自治区）尚未提交滥用“麻谷丸”的报告［5］。



（2）在人口学特征方面，滥用者中女性所占的比重较高，占32.7%；多数滥用者具有初中及高中文化；主要为无业和个体经营者。

女性滥用者所占比重与近年监测报告的苯丙胺类物质滥用者性别构成情况较为相同。而女性滥用者比例高预示着毒品滥用问题严重［8-9］。



（3）与滥用麻谷丸的有关行为方面，初次滥用麻谷丸的年龄30 a 以下者占53.2%。满足好奇、追求欣快/ 刺激是滥用麻谷丸的主要原因。由于青少年具有涉世不深，对事物充满了新鲜、好奇，想要尝试，喜与众攀比的特点，再加上对滥用新型毒品的危害缺乏必要认识，很难抵御麻谷丸稀奇的滥用诱惑。

近年来，青少年药物滥用现象日趋严重，吸毒行为往往发生在初中毕业之后［10］。因此，进一步深化面向青少年的禁毒宣传，特别是强化有关新型毒品知识和危害的宣传活动，是十分必要的。



（4）在毒品可获得性和滥用场所方面，麻谷丸主要获得渠道来自同伴和亲友以及娱乐场所；暂住地/ 宾馆/ 出租房和歌舞厅/ 酒吧/ 游艺厅/ 浴室成为滥用麻谷丸主要场所，这无论从非法供应途径，还是在滥用毒品的场所地点，有较大隐蔽性和诡秘性，使打击毒品非法供应与非法需求的难度增加。

麻谷丸的滥用环境有别于“ 摇头丸”，据滥用者陈述不需要“嗨伴”以及高分贝的音响环境，同时随着公安部门加大对娱乐场所涉毒的打击力度，也使得麻谷丸的滥用场所发生变化，滥用毒品行为不仅发生在娱乐场所，也开始出现在宾馆和社区。这对管理宾馆的单位和社区管理部门提出要求，除了进行禁毒宣传教育活动外，需要加强自我防范和自我管理的意识，深入推进无毒社区的工作。

监测资料提示麻谷丸已经成为涉及地区广、蔓延速度快的新型毒品，应引起药物滥用防制机构的警觉和重视，研究采取控制和预防流行的应对措施。

本监测资料主要来源于戒毒机构及缉毒部门，数据样本有限，尚不能完全反映新型毒品的滥用现况，研究报告仅限于对调查数据的描述性分析，结果仅供作为进一步研究工作的基线信息。





致谢：提交有关麻谷丸滥用报告的各省级药物滥用监测站和戒毒机构及部分地区缉毒部门的工作人员。

                                 

兴奋剂类分析方法系列讲座（10）-GC-MS 测8种β-兴奋剂 

气相色谱一质谱法同时测定动物性食品中

8 种β-兴奋剂的残留量



摘 要 

目的：应用 OasisMCX 固相萃取净化、气相色谱-质谱同时测定动物组织样品中8种 β一兴奋剂（克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布它林、喷布特罗、心得安、倍他索洛尔、非诺特罗）的残留量。

方法：样品粉碎后经β一葡萄糖醛苷酶水解用乙酸钠缓冲溶液提取 MCX 固相萃取柱进一

步净化，再用 N , 0 双（三甲基硅基）三氟乙酰胺一三甲基氯硅烷(BSTFA十TMCA,99十 l ）

衍生化，用美托洛尔（metopiobl 为内标。采用选择离子监控模式（ SM ）检测，GC-MS测定分析，

结果：8种β-兴奋剂不同水平的加标：回收率范围为 51 . 9 % ~101 . 7 % ( n = 6 ）相对标准偏差为 2 . 7 ％~16 . 0 % (n= 6 ) ,

结论：本方法操作筒单．灵敏度高，选择性和重复性好。                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                 



本文是北京市自然科学基金资助项目，由北京市疾病预防控制中心的孟娟，邵兵、吴国华、薛颖等研究人员共同完成，为2008年奥运会中兴奋剂的检测有一定参考意义。现全文介绍如下。



前 言

β-兴奋剂（属于苯胺类和苯酚类药物）是一种可以引起交感神经兴奋的类似肾上腺素的药物，被广泛应用于人类哮喘和心脏病的治疗，在高于治疗剂量长期服用时可使体内的营养成分由脂肪组织向肌肉组织转化，提高饲养动物的瘦肉率，但是激素类药物存在着潜在的生理毒性，人长期食用会出现头痛、胸闷、神经过敏、肌肉痛、心悸、恶心等症状。因此其使用受到国际社会的严格限制，β一兴奋剂类药物残留的检测技术多集中在克伦特罗苯胺类单一成分的测定上，现在人们更多致力于探索同时测定多组分β一兴奋剂的方法。

本文应用GC-MS 同时测定动物性织织中 8种β-兴奋剂类药物［克伦特罗、沙丁胺醉、妥布特罗、特布它林、喷布特罗、心得安、倍他索洛尔、非诺特罗的残留量，对前处理的关键步骤进行了多种处理方法的比较，讨论了衍生化时间、洗脱剂的选择、样品过柱前 pH 的选择等．最后对方法进行了优化处理，得出了理想的实验结果。



实 验

l  材料与方法

1 . 1 试剂与仪器

妥布特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、特布它林、克伦特罗、喷布特罗、心得安、倍他索洛尔、美托洛尔（sigma公司．纯度 >99%）；衍生剂： N , 0 一双甲基硅烷三氟乙酰胺（ BSTFA) ；甲醉，乙醇、甲苯均为色谱纯；浓氮水为分析纯；OasisMCX 固相萃取小柱（ 500 mg . 3cc , waters 公司）：混合型的固相萃取柱，其有反相和阳离子交换的功能： HP -5ms气相色谱柱（ 30m×0.25mm×0.25μm ）超声波清洗仪；酸度汁；离心机； 24 位固相萃取仪（Waters公司） ; 6890 气相色谱一 5973 质谱联用仪

( Agilent 公司）。

1 . 2 样品处理

将动物组织样品切碎混匀．准确称取 5.0g，置于 50 ml 离心管中，加入 50 μL β一葡萄糖醛苷酶，再加入 20 ml  pH 5 . 2 的乙酸钠缓冲溶液．添加 100ng美托洛尔内标，涡旋混匀， 50 ℃ ±2℃ 孵育 2 h。冷却后加入 0 . 1 mo1/L 高氯酸 10 ml 于超声波清洗器超声 30 min ，再 80 ℃ 水浴 30min，冷却后，于 5000r/min离心 5min 。上清液转移到另一离心管中．再加入 5 mL高氧酸溶解残渣．离心，合并两次上清液用 NaOH ( 0 . 1 mol/L ）调 pH 为 3 . 0 ，以 5 000 r/min离心，将上清液全部过柱.。OasisMCX 固相萃取小柱 〔 500mg : 3cc）依次用 6 ml 甲醇 6  ml超纯水活化,将提取液以 lml/min 速度通过固相萃取小柱．再依次用 2 mL  0.lmoL/L 高氯酸、 2 ml 甲醇、 2 ml 水、 25 ％甲醇水中含 5 ％氨水洗涤固相萃取柱以去除中性杂质，弃去洗涤液，用 6 ml 含有 5 ％氨水的乙醇溶液淋洗．收集淋出液，在微弱氮气流下吹至近干。

1 . 3 衍生

将吹干的样品残楂中加入 BSTFA 100 μL密闭，充分涡旋混匀后．置 75 ℃ ±5 ℃ 烘箱中，衍生 30 min．凉置室温后用氮气吹干再加入 1 . 0 mL 甲苯充分溶解，即可上机测定。 1 . 4 气相色谱一质谱测定

色谱条件：毛细管柱 Hp 一5ms色谱柱．柱温条件为：100 ℃ 保持 1 min ．以 30 ℃/min升到 190 ℃ ，再以15 ℃ /min 的速度升至 225 ℃ 并保持 5min．再以 30 ℃/min的速度升至 300 ℃ 并保持 5 min ．载气： He 流速： 1 . 2 ml/min ;进样口温度： 260 ℃ ，不分流进样，进样量1μL 。

质谱条件：电子轰击(E I）离子源，电子能量： 70eV；扫描范围： 50~500 （m/z ) ，接口温度： 230 ℃ ，倍增器电压：12OV ；N IST107谱库，样品的定量测定采用选择离子模式以多点校正定量，妥布特罗的特征离子为 86 ，194 ，228 ，克伦特罗的特征离子为 86，187 ，243 。喷布特罗的特征离子为 86 , 101 . 247 ，348 ．心得安的特征离子为 72 , 115 , 144 ，215 , 倍他索洛尔的特证离子为72， 101 ，263，364 。特布它林的特征离子为 356 , 86 . 426 。沙 丁醇胺的特征离子为 369 , 86 , 350 ，非诺特罗的特征离子为 322 , 356 . 236 .



2  结果与讨论

2 . 1 色谱图

标准品色谱图、猪肝空白色谱图、加标样品色谱图见图1~ 3 。

兴奋剂类分析方法系列讲座（10）（下）-GC-MS 测8种β-兴奋剂

2 . 2 洗脱剂的选择

用乙醇+ 氨水（ 95 + 5 ）溶液与甲醇+氨水（ 95 十 5 ）溶液以及乙酸乙酯+氮水（ 95 十 5 ）溶液洗脱样品的能力进行了试验比较。结果表明，乙醇氨溶液洗脱后的样品回收率高，杂质量低，干扰少。

2 . 3 固相萃取柱的选择

由于β-兴奋剂类药物结构中含有疏水的饱和烃链，可以采用 C18 反相固相萃取柱。因此，我们采用了阳离子型的固相萃取柱-MCX柱，同时，还对比了Oasis ELB 柱的选择性效果，发现 HLB 的选择性较差，样品基质的干扰较大．而 MCX 柱为混合键合相硅胶柱。对目标物质有较好的保留效果，

2 . 4 提取液 pH 的影响

固相萃取前将溶液调到 pH 为 3.0、 4 .0、 5 .0、 7 .0、 9 . 5 进行比较实验，结果表明，当 pH 为 3.0时回收率最高。

2 . 5 衍生化条件的优化

衍生化温度选择 60 ℃ 、 70℃ 、 80℃，衍生 30 min 与 l h 的衍生化产物峰面积以 70 ℃ 为最大。所以，选择 70 ℃ 为衍生温度。

在 70 ℃ 下衍生化反应时间分别为 30 min 、 l h 、1.5 h、 2 h ．结果表明，衍生化产物峰面积在 30 mm 和 lh 均比 l .5h 和 2 h 大，所以选择衍生化时间为 30 min .

2 . 6 线性范围及检出限

分别取（ 100μg/L ）的β-兴奋剂混合标准溶液 1.0、 5 .0、 10.0 、 25.0 、 50.0 、 100 .0 、 200.0 ng ，以分析目标物质的峰面积与内标峰面积之比值对浓度进行线性回归，相关系数大于。0.999 ，说明本方法对分析目标物质在较大浓度范围都具有较好的相关性，方法检出限为：妥布特罗0.5μg/kg；克伦特罗0.5μg/kg；喷布特罗5μg/kg；心得安0.5μg/kg；倍他索洛尔0.5μg/kg；特布它林 5μg/kg；沙丁醇胺0.5μg/kg；非诺特罗5μg/kg； ( S/N = 3 ) ,

2 . 7 方法的回收率和精密度

取一实际猪肝样品作为本底，分别向样品中添加了 3 个浓度标准，做加标回收试验。 6 次的平均回收率及重复测定的相对标准偏差实验结果如表 l 所示，



3  小 结

采用气相色谱。质谱法同时测定多组分的β-兴奋剂，方法准确、快速、灵敏度高，动物组织样品在测定中会遇到严重的背景干扰，但是通过使用固相萃取净化大大降低了杂质(主要是月脂肪类物质）的干扰，即使是低浓度测定中，也有足够的检测离子进行定量。并且可以同时测定多组分β-兴奋剂．使用固相萃取法提取样品减少了试剂的使用量，降低了有机溶剂的毒性对操作者身体健康造成的危害，既省力又安全，值得广泛推广，

兴奋剂类分析方法系列讲座（11）-挑战基因兴奋剂


挑战基因兴奋剂——2OO8北京奥运反兴奋剂工作的焦点



摘 要  运用文献资料法和逻辑分析法．阐述了基因兴奋剂的由来、研究及危害，提出基因兴奋剂将是2008北京奥运会兴奋剂检侧的挑战。



前 言

    北京奥运会兴奋剂检测的挑战兴奋剂不仅是体育的痼疾，同时也是人类社会诚实与欺骗、健康和生命的最大难题。欧洲顶级的反兴奋剂专家预测，随着科学和医疗的发展，一小部分为了追求成绩铤而走险的教练和运动员，已经将目标瞄准了更为隐蔽、更加危险的基因兴奋剂，基因兴奋剂将是2008年北京奥运会反兴奋剂工作的焦点。



本文由福建警官职业学院警察训练部林军讲师所撰写，她的研究方向是体育教育训练学，现全文介绍如下。



1 基因兴奋剂的由来

基因兴奋剂是指将可提高运动成绩的基因或DNA通过基因治疗方式导入运动员与运动能力相关的靶细胞内进行基因改造，以获取竞技优势的方法。由于基因治疗研究的快速进展，基因治疗技术的一些成功应用，使运动员使用基因兴奋剂成为可能，而基因兴奋剂的使用一旦成功，其高效性、隐蔽性必将使运动员们趋之若鹜，甚至不惜铤而走险。根据目前水平，医疗科技人员同样可以按照需要对运动员的基因进行改造、替换。这样，运动员将用不着艰苦训练，凭借基因改造便可能取得优异成绩。



2 基因兴奋剂的研究

尽管到目前还没有基因改造运动员的确切证据，但是，许多体育科研人员正在研究基因疗法，并且这项技术在动物实验方面已经取得了不小成就。

现在，能使血液中红细胞生长素大大增加的“变异基因”已被科学家找到，并可使用先进的基因疗法对运动员的基因加以改造。这些增长的血液红细胞，可以把更多的氧气运送到人体的各个组织中，其体力和耐力就会大大增强。据称，超量分泌红细胞生长素能使运动员的速度提高20％以上。

还有一种基因技术方法，有可能被应用于增强运动员某一特定部位的肌肉，可以通过注射，让身体的某一局部在短期内长出强健的肌肉。实际上，早在1994年，美国芝加哥大学医院就成功地在动物身上完成了这种基因改造试验。根据萨尔丁的研究成果，如果从一只苍蝇身上取出一种基因，经过有目的的修改后重新将基因注射进苍蝇体内，这只苍蝇身上用于飞行的肌肉比注射前强化了近300倍。除了肌肉以外，身体的其他部分如肌腱也可以用转基因技术进行改造。肌腱连接骨骼和肌肉，是运动员比较容易受伤的部位，基因科学家将来可能用经过转基因处理的细胞组织制造出不怕跌打损伤的合成肌腱。



3 基因兴奋剂的危害

3．1 严重危害运动员的身体健康

基因治疗是“双刃剑”，毕竟目前基因治疗技术本身还存在着诸多安全问题，长期效果及副作用也有待验证。基因改造后的运动员会获得令人瞠目的竞技成绩，但是这个成绩是不公平的，犹如使用兴奋剂一样。使用基因兴奋剂的后果，同样是会给人体带来难以述状的损伤。能使血液中红细胞生长素大大增加的“变异基因”会使血液里的红细胞过多，造成血黏度上升、血液流动缓慢、血管腔逐渐变窄，极易出现血液循环障碍，最后可能引发高血压和中风等疾病，重者导致猝死。短期内使用基因兴奋剂，会暂时增强肌肉能力，但随之而来的是比其他种类的兴奋剂危害更大的后果——难以挽回的肌肉萎缩和早衰。更严重的是，人体细胞组织的染色体结构一旦被改变，其后果是永久性的。这些细胞将自行分裂繁殖，有可能就是肿瘤的生长因子，而对人体各种机能的平衡运动产生什么影响，科学家们还无法估计，也无法控制。

3．2 违背了奥林匹克运动的根本宗旨

《奥林匹克宪章》明确规定：公平竞赛是奥林匹克的根本原则，要“努力使运动中普遍贯彻公平竞争的精神”。所谓公平竞争，就是要保证参赛运动员以相同的身体条件在同一场地中共同遵守同样的比赛规则进行竞赛。如果允许使用基因兴奋剂，一个杰出的、努力奋斗的运动员就很可能输给一个水平比他差但服用了基因兴奋剂的对手，这样就破坏了公平、合理竞争的竞赛原则，改变了奥林匹克运动的宗旨，从根本上导致体育运动的畸形发展。成功应该是通过训练来提高一个人原有的能力而获得的，使用药物来提高运动成绩是一种欺诈行为，在体育比赛中是绝不允许的。因此，借助使用基因兴奋剂来提高成绩不但违背了体育运动公平竞赛的精神，更是违反体育道德和体育法规的非法行为。同时也玷污了公众对体育的信念，背离了体育的宗旨，极大地亵渎了奥林匹克精神和理想。所以，基因兴奋剂的危害会远远超过普通兴奋剂，对奥林匹克竞技体育的打击也是毁灭性的。



4 世界反兴奋剂的现状

2003年，国际奥委会已将基因兴奋剂列入违禁药物的黑名单。同时，为了取得反基因兴奋剂战斗的主动权，世界反兴奋剂组织(WADA)已于2003年将基因兴奋剂列入禁用药物和方法之列。WADA主席Pound说：“我们希望金牌给予那些诚实竞争的运动员，而不是他们背后的药剂师或技术人员；我们需要的是运动员，而不是角斗士；我们需要的是真正的人，而不是突变体”。

让人感到棘手的是，基因兴奋剂和其它兴奋剂药物不同，尿检和血检均不能有效查出，原因在于它是从细胞水平增强人体天然细胞功能来发挥作用的。目前唯一可用的方法就是肌肉活组织切片检查，但是很明显，运动员参加比赛时，不可能让检测人员切掉一块肉，因此远远不像取尿样或血样那么简单，所以目前的检测操作性不强。然而，对此的科学研究正在不断取得进展。2004年9月Lasne和Chenuand发表了关于检测红细胞生成素基因兴奋剂的研究，展现了肾小管成纤维细胞和注入基因后骨骼肌产生的血红细胞生成素之间的细微差别。根据通过跟踪血清上的等电聚焦点取得的双印迹，能清楚地看出有、无基因注入的猕猴产生的血红细胞生成素的差异。此外，同一动物在基因注入前后产生的血红细胞生成素在形态上有差异。这些发现有助于对红细胞生成素基因兴奋剂的检测。



5 北京奥运会反兴奋剂工作的挑战

中国反兴奋剂的立场是鲜明的、一贯的。早在1989年，国家体育总局就提出兴奋剂“严令禁止、严格检查、严肃处理”的“三严”方针，此后10多年来制订了30多个行业法规性文件。尽管10多年来我国的反兴奋剂工作在不断进步，成绩有目共睹，但由于兴奋剂是国际社会的一个公害，反兴奋剂斗争极其复杂，任务极为艰巨，因此，反兴奋剂

的斗争依然任重道远。

2008年北京奥运会，我国的兴奋剂检测工作还要更上一层楼。据了解，奥体中心西北侧将要兴建一座占地5 600 m2、三层楼的新的兴奋剂检测中心，仪器设备的数量和水平都要上一个台阶，还要组织一系列科研攻关，研究不同药物的不同检测方法。

随着基因治疗技术的飞速发展，国际反兴奋剂机构(WADA)和国际奥林匹克委员会(IOC)都担心，一些使用了基因兴奋剂的运动员可能会出现在2008年北京奥运会上。面对严峻的形势，从现在起至2008年，中国兴奋剂检测中心将要拿出新的“杀手锏”。我们要努力走在世界前列，进行科技仓q新。比如，利用基因技术、生物芯片、肽类激素检测、生长激素检测、改进EPO检测方法等，给北京科技奥运增加新的亮点。

兴奋剂类分析方法系列讲座（12）-综述促红细胞生成素检测方法

促红细胞生成素的血液检测方法



摘 要：重组人促红细胞生成素(rHuEPO)被禁止用于提高运动员的成绩，但是用常规的检测方法很难区分内源性EPO和外源性EPO。运动员使用EPO后，会导致其一些血液参数的变化，通过对这些血液参数的检测，可以间接判定运动员是否使用了EPO。笔者综述了促红细胞生成素的血液检测方法的研究进展，明确指明了EPO血液检测的原理和方法，并重点讨论了转铁蛋白受体和网织红细胞参数等指标的检测原理和方法。



    本文由华东师范大学体育与健康学院的周 刚、许豪文两位老师共同完成检测促红细胞生成素在血液中含量及综述，同时介绍悉尼奥运会的EPO血检方法，以利我国奥运会检测人员参考。



1  EP0和rHuEPO

增加红细胞量对于提高运动成绩的好处已被广泛的报道。就目前而言，增加血红细胞量的途径主要有：持续的艰苦训练或高原训练；采用血液回输技术； 注射促红细胞生成素。

毫无疑问，即使在高水平运动员中，靠持续的艰苦训练或高原训练，要大幅度地提高自身固有的血液浓度和血红蛋白含量是很困难的。于是，有人便另辟“捷径”， 企图通过采用不正当手段来实现上述目的。20世纪70年代．一些长跑运动员曾在慕尼黑(1972)和蒙特利尔(1976)两届运动会上利用自体输血的技术参加比赛，有的运动员还取得了金牌 [1]。随着检测技术的发展，用常规的尿检方法已能很容易地检测出血液兴奋剂的滥用，于是，一些运动员便转向使用其它尿检不易查出的兴奋剂，这其中便包括EPO [2]。 而今，促红细胞生成素已成为目前国际体坛“最具欺骗性的药物”。

人体的肾脏能产生一种红细胞生成酶(erythrogenin)，这种酶作用于肝脏所产生的促红细胞生成素的前身(一种α-球蛋白)促红细胞生成原(erythropoietinogen)，它们在血浆中转变成人促红细胞生成素 (Erythropoietin，EPO) [3 ]。最近发现，肝细胞和巨噬细胞也能产生EPO。EPO属酸性糖蛋白，它与红细胞前体细胞表面EPO受体结合，促进其血红蛋白的合成，使之增殖分化成红细胞，从而调节体内红细胞和血红蛋白的生理平衡。它的表达有其严格的组织特异性，同时严格受体内氧分压的控制。正常情况下人血液中EPO水平保持在4×10 -3 ～24×10 -3 U／mL，再生障碍性贫血患者因组织严重缺氧，血液中EPO水平可高达10U／mL [4]。

早年从再生障碍性贫血病人的尿中、胎肾细胞的培养液中可获得较多的EPO。1985年应用基因重组技术， 获得重组人EPO (Recombinant Human Erythropoietin，rHuEPO)，有了大量纯品EPO 的问世，使EPO 得以在临床上广泛应用[5—6 ]。rHuEPO与EPO的作用极为相似，可以明显提高人体的红细胞数量及血红蛋白含量，从而提高人体运输氧的能力，提高人体最大摄氧量。在使用rHuEPO 4—7天后，rHuEPO已恢复正常水平，应用常规检测的色谱学方法无法查出，而其功效还可持续四周之久，这正是有氧耐力运动员所期望的。因此，在2 0世纪80年代，人工合成的rHuEPO开始被用作体育训练及竞赛中的辅助药物，个别人为了追求良好的训练及比赛成绩并逃避药检，越来越多地服用此类药物，rHuEPO也被直接称为EPO。然而，rHuEPO的滥用可导致血小板功能亢进、高血压、中风等疾病，严重者甚至死亡。有鉴于此，1989年国际奥委会医学委员会将EPO等4种人工合成的肽类激素正式列为禁用药物。



2  rHuEPO的血液检测原理

由于检测技术的原因，EPO在体能类运动项目中的滥用一直无法进行有效的控制。有三个方面的因素限制了EPO的检测，这些因素是：其一，rHuEPO 与内源性EPO的分子结构极为相似。EPO是一种含有166个氨基酸的单链酸性糖蛋白，分子量为34000D (道尔顿)，而rHuEPO的分子量为30400D，也是单链糖蛋白[7]。现在还没有技术能从统计学上鉴别、分离和确定rHuEPO的数量 [8 ]；其二，rHuEPO与内源性EPO相似的临床效果。其功能都是刺激造血祖细胞分化为红细胞；其三，rHuEPO的平均半衰期大约为6h，大多数rHuEPO在1—3d内被身体清除，然而其功效仍可以持续四周[9]。因此，按常规的尿检或血检方法很难直接检测出rHuEPO的存在，更少有机会通过血清的EPO水平检测出滥用者，尤其是在竞赛期间。

研究表明，在停止注射EPO四周后，体内EPO恢复到正常水平，甚至低于正常水平 。这就是说，为了保持其有效性，兴奋剂使用者不得不在赛前四周内注射rHuEPO，而最佳的使用效果是在赛前两周内注射。这就给兴奋剂检测者提供了一个检测出当前或最近使用了rHuEP0的运动员的机会。

从这个思路入手，一些研究表明：rHu EPO的使用不可避免地会导致血液中一些生理生化指标的改变，这些指标包括可溶性转铁蛋白受体(soluble transfemin Receptor，sTfr)和与血红细胞及网织红细胞相关的各种参数，如红细胞压积(hematocrit，Hct)，血红蛋白含量(Haemoqlobin，Hb)和网织红细胞计数(reticulocyte count， # retic) 等等[2、8、11、13、14]。依赖于对这些间接指标的检测， 与没有用rHuEPO的正常人的指标相比较，可用于查明运动员当前或近期滥用rHu EPO，这是目前EPO检测的一个现实思路。

国际自行车联合会曾以红细胞压积(Hct)超过50％为界线来判定使用了EPO [15]，而国际业余滑冰组织则以血红蛋白(Hb)超过18.5g×dL -1 来判定明显地使用了EPO。然而，Hct和Hb是相当粗糙的血液特征检测指标。血液特征受脱水，心情和运动方式的影响，并且50％ 的限制不排除个别优秀运动员有自然的高Hct。

早期的研究还有检测滥用rHuEPO 的间接指标Tfr [14,16,17]。 一项最近的研究指出，在最后一次使用rHuEPO后的25d内，Tfr还高于正常水平。一项运动员使用rHuEPO的药动学研究表明，尽管用药后4到7天内EPO已回落到正常水平，但直到用药后第14d，许多血液学指标还高于正常水平 。

另外，最近的几项关于rHuEPO的研究报道， 网织红细胞绝对计数(# retic)，每个网织红细胞的血红蛋白含量(CHr)，网织红细胞的血红蛋白总量(RetHb)，血红细胞的血红蛋白与网织红细胞的血红蛋白的比率(RBCHb：RetHb)等指标也可做为检测rHuEPO的间接指标 [8,10,11]。国内外现在已有大量关于EPO检测方法的报道，下面重点对EPO的血液检测方法做一综述。



3  rHuEPO的血液检测方法

3．1 转铁蛋白受体（Transferrin Receptor，Tfr)

Tfr为一双糖蛋白，分子量为2×94000D，实际上存在于所有细胞的表面上。但成人中，约有80％存在于骨髓成红细胞中。当红细胞受到EPO的刺激时，Tfr会将与其结合的血液中富含的转铁蛋白中的铁转移到血红蛋白的卟啉中。随着红细胞的成熟，Tfr及Tfr的一些碎片将被释放进入血液循环。因此，以免疫方法定量测定血中的Tfr及其碎片可以提供一个可能的方法以检测外源EPO的使用。国内外许多相关的实验都证实了Tfr作为检测rHuEPO的间接指标的可靠性[11,13,14,17]。以下是一些这方面的实例。

加拿大的Gareau等人报道：以50100 IU／kg．bw的EPO进行每周三次的皮下注射后，以酶联免疫吸附法 (ELISA) 测定给药组 (n=24) 血清中的Tfr的浓度为3135±312ng／mL，而对照组 (n=6) 的血清浓度为2195 ±225ng／mL (P<0.001) [16]。在Gareau等人的另一项实验中也得出同样结果，rHuEPO的滥用导致Tfr的延迟性增加和fr (铁蛋白) 的延迟性减少，及Tfr／fr升高。作者提出，可用Tfr和Tfr／fr作为检测运动员滥用rHuEPO的指标 [l4]。

方子龙等给6名健康青年男性受试者皮下注射rHuEPO，剂量为30 IU／kg体重，每周3次，持续4周，采用ELISA进行指标测定。结果表明，注射rHuEPO能提高血清EPO浓度和转铁蛋白可溶性受体Tfr的浓度；在停药后1个星期左右的时间内，Tfr浓度仍保持在较高水平。结果提示：血清EPO和Tfr浓度有可能作为rHuEPO检测的指标 [18]。

法国的Audran等人也做了相关的实验：给9名运动员每人每天皮下注射50 IU / kg的rHuEPO，持续26天。分别于用药期10，14，17，24天和用药后1，3，7，14，25天抽取

血样分析。结果表明，rHuEPO的滥用，使运动员的有氧能力明显提高，同时，用药期间及停药两周内Tfr和Tfr／fr均显著升高。作者提出，以Tfr高于10 μg／mL和Tfr／fr高于

153，来判定是否使用了rHuEPO [11]。

多年来，国外在Tfr的检测方面已做了大量的研究，可以肯定的是，Tfr已成为目前EPO检测中最为可靠，最为常用的指标。

兴奋剂类分析方法系列讲座（12）（下）-综述促红细胞生成素检测方法

3．2 网织红细胞参数

网织红细胞(reticulocyte)是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间尚未完全成熟的红细胞。因其胞质内尚存留多少不等的嗜碱物质RNA，经煌焦油蓝、新亚甲蓝等活体染色法染色后，嗜碱物质凝聚成颗粒，其颗粒又可联缀成线，而构成网织状，此种红细胞即网织红细胞[19]。滥用rHuEPO将导致血液中的网织红细胞的参数变化。这些参数包括网织红细胞绝对计数(# retic)，每个网织红细胞的血红蛋白含量(CHr)，网织红细胞的血红蛋白总量(RetHb)，血红

细胞的血红蛋白与网织红细胞的血红蛋白的比率(RBCHb：RetHb)[18,11] 。

澳大利亚的Parisotto等人对此进行了深入的研究。在一项实验中 ，他们以自行车、游泳、赛艇、田径和越野滑雪等项目的国家级和世界级运动员(n=155)为对照组，对照组又分为模拟高原训练组和高原训练组；以健康的非运动员男性(n =23)为实验组，实验组又分为三组，A组在l、4、7、l0天每天注射300U／kg rHuEPO，B组在l、5、 9天每天注射400U／kg rHuEPO ，C组在1、10天每天注射600U／kg rHuEPO。在第l1天采样，采用流量血细胞计数法进行分析。实验结果显示：注射rHuEPO的非运动员的网织红细胞参数明显地不同于正常训练的优秀运动员的，也不同于在高原或模拟高原训练的运动员的。注射rHuEPO的非运动员的# retic增加近三倍 (注射rHuEPO前后的# retic分别为25—53×l09／L和193—260×l09／L)，RetHb增加近两倍，同时，RBCHb：RetHb明显降低。作者认为，最好的检测rHuEPO 的指标是# retic， 其次是RetHb 和RBCHb：RetHb。据此检测的失误率在10000例被试中不超过7例(95％置信区间)。作者建议可用网织红细胞参数(# retic，RetHb，RBCHb：RetHb)作为检测优秀运动员当前或最近滥用rHuEPO的间接指标。另外，这项实验同时也说明了高原训练和模拟高原训练不影响这些指标的可靠性。

上述Audran等人的实验也检测到，从注射rHuEPO到停止使用rHuEPO的25天内， 网织红细胞参数都发生显著性变化 (P<0.01) [11]。

3．3 悉尼奥运会的EPO血检方法

1999年澳大利亚体育学院(AIS)成立了“EPO2000”科研攻关组，并协同澳大利亚体育运动兴奋剂检测实验室(ASDTL)联合进行一项注射EPO的课题，该课题后来被命名为“EPO2000”研究计划[22]。这项研究课题后来又有许多国家和地区的专家共同参与攻关(包括澳大利亚、法国、加拿大、挪威和中国)，上述研究者Parisoto，Gareau，Audran等都参与了该计划。

国际奥委会执委会在2000年8月28日正式通过了在悉尼奥运会上采用“EPO2000” 研究的EPO血检和尿检方法的决定。其中澳大利亚科学家的血检研究成果意义更加重大，因为这是奥运会历史上引进的第一项血检技术，它突破了尿检技术只有在服用EPO后三天内检测才有效的局限性(尿检方法为法国科学家研究成功)。

澳大利亚体育学院Parisotto等人2000年发表在血液学杂志上的实验报告[20] 成为国际奥委会最终同意在悉尼奥运会进行血检的重要参考性文献[22 ]。该实验将27名运动员分为三组：EPO+IM 组(n=10)， 注射rHuEPO和铁；EPO+OR组(n=8)， 注射rHuEPO和口服铁；安慰剂组(n=9)。用药期为三周，每组被试在用药期和用药后四周内的血液学和生化指标被检测。实验者从检测的众多指标中筛选出5个指标，它们是：Hct，网织红细胞压积(reticuloeyte hematoerit,RetHct)， 巨红细胞百分比(percent maeroeytes， ％Macro)，血清EPO和sTfr。实验设计了两种分析模型：ON—model和OFF—model。ON—model应用于rHuFPO使用期，在rHuEPO使用期的最后两周，通过综合分析上述五个指标，能够检测出94—100％ 的rHuEPO使用者；OFF—model应用于停药后，综合分析RetHct，EPO和Hct，在停药后的12—21天，能够检测出67—72％ 的rHuEPO使用者。由此证明。这五项指标可用于检测当前或最近滥用rHuEPO的运动员。

澳大利亚和中国合作也做了相关的实验。在这项实验中，Parisotto等人在悉尼和北京两地分别对49名和24名运动员进行了EPO实验。每名被试每天被注射50 IU／kg rHuEPO，持续25天。结果显示，两地被试血液中的上述五项指标在注射rHuEPO期间及注射后4周内均有异常变化。作者认为，通过检测这五项指标，完全可以准确地查出数周内滥用rHuEPO的运动员 。该实验的另一意义在于补充黄种人(人种)和中国人(民族)的EPO检测数据。

综上所述，采用检测rHuEPO导致的血液中一些“间接指标” 的变化来判定优秀运动员当前或最近滥用rHuEPO是行之有效的方法，尤其是综合多项指标来进行分析，并结合尿检时，对于数周内使用rHuEPO者的检测，其准确率几乎100％ 。然而，尽管检测EPO的方法已日臻完善，但对于高原训练与内源EPO的产生，不同地域和不同人种红细胞数量的不同等方面研究成果还相对缺乏，这限制了EPO血检技术的应用，这也是悉尼奥运会最终采用尿检与血检共同使用，而不单以血检结果判定滥用rHuEPO的原因之一。如何解决这些难题， 使EPO的检测方法准确而无隙可击将是兴奋剂检测工作者进一步研究的课题。

谢谢楼主。

兴奋剂类分析方法系列讲座（13）HPLC同时分析尿中39种药毒物 
固相萃取HPLC同时提取分析尿中39种药毒物



摘 要

目的  固相萃取方法同时提取尿中39种药毒物并用高效液相色谱法进行分析。

方法  以多沙普仑为内标，1mL尿样经Oasis小柱固相萃取后，用HPLC进行分析，39种药毒物可同时从尿中提出，内源性物质不干扰测定。

结果  39种药毒物的绝对回收率除吗啡外均大于70%；天内及天间精密度均小于10%；检测限1~15 ng·mL-1；线性相关系数在0.9977以上。

结论  本法快速、简便、重现性好，空白干扰小，可用于实际案例的药物毒物筛选。



本文由张玉荣1，梁晨2，金琦芸2，郭幼梅2，张润生1，王跨陡1，王威1，严松茂1（1.上海市刑事科学技术研究所；2. 复旦大学药学院药物分析教研室）等研究人员合作为寻找在HPLC方法上快速分析筛选39药毒物的方法，他们做了大量的基础工作，该文是初始文还缺一张尿中添加39 种药毒物的HPLC图，找到相关的应用成果会继续向大家推荐。



前 言

固相萃取作为从生物样品中提取净化微量药物或其代谢物的方法，已被广泛地应用于生物样品的检测中，其中尤以与HPLC技术结合用于生物样品的分析引人注目[1-4]。在实际工作中，由于案例情况各有不同，分析人员即使怀疑是相同的目标物也可能采用不同的方法（包括检材的处理、仪器条件、数据处理等）。同一案例，不同分析者采用不同的前处理方法，不同仪器，可能会产生不同的结果，也就是说在方法与方法之间很难进行比较，而对于不同的目标物或目标物完全未知的案例所采用的方法更是千变万化，这样就有产生错检、漏检的可能。因此，药毒物分析工作者一直在试图寻找一个既实用又通用的药毒物的系统筛选方法，可以在不同实验室、分析者、仪器之间进行比较，从而提高分析结果的可靠性。

目前已报道的固相萃取文献大多只涉及到几种或某一类药毒物的分析[2-4]，本文希望通过扩大药物的覆盖面，建立一种可快速、同时测定多种药毒物的切实可行的并具有通用性的方法，用同一种前处理方法同时提取尿中的多种药毒物，以满足实际检案的需要，同时也可作为建立一个实验室之间通用的系统筛选方法的参考。



  实 验

1  材料和方法

1.1 仪器

HP1100系列高效液相色谱仪（配置G1315光电二级管阵列检测器）；HACH sension1型pH测定仪。

1.2 对照标准品和试剂

39种对照品：普鲁卡因（procaine）、哌唑嗪（prazosin）、苯妥因钠（phenytoin sodium）、导眠能（glutethimide）、戊巴比妥（pentobarbital）、氟硝西泮（flunitrazepam）、安眠酮（methaqualone）、三唑仑（triazolam）、吗啡（morphine）、克仑特罗（clenbuterol）、O6-单乙酰吗啡（O6-monoacetylmorphine）、可待因（codeine）、O3-单乙酰吗啡（O3-monoacetylmorphine）、福尔可定（pholcodine）、氯硝西泮（clonazepam）、艾司唑仑（estazolam）、阿普唑仑（alprazolam）、替马西泮（temazepam）、地西泮（diazepam）、氯喹（chloroquine）、马钱子碱（brucine）、美沙酮（methadone）、氟西泮（flurazepam）、多虑平（doxepin）、奋乃静（perphenazine）、氟奋乃静（fluphenazine）、异丙嗪（promethazine）、氯丙嗪（chlorpromazine）、氯普噻吨（chlorprothixene）、三氟拉嗪（trifluoperazine）、罂粟碱（papaverine）、蒂巴因（thebaine）、那可汀（narcotine）、苯海拉明（diphenhydramine）、氯氮平（clozapine）、布比卡因（bupivacaine）、丙咪嗪（imipramine）、阿米替林（amitriptyline）、泰尔登（tarden）及内标多沙普仑（doxapram）均由中国药品生物制品检定所提供；

对照品和内标均配成浓度为1mg·mL-1的甲醇储备液，将对照品储备液分组混合并用甲醇稀释成工作液；二氯甲烷、三乙胺、氨水均为分析纯，正己烷为光学纯，甲醇为色谱纯；取三乙胺100mL加水1200mL混合，用冰醋酸调节pH到8.0，最后加水至1500mL，配制成三乙胺缓冲液；Oasis固相萃取小柱（HLB 1cc/30mg）购自Waters公司。

1.3  方法

1.3.1  样品处理 

依次用1mL 甲醇、1mL水通过固相萃取小柱，精吸1.0mL尿样上样后依次用1mL 2%氨水5%甲醇的水，1mL 5%甲醇的水清洗，然后将固相萃取小柱离心甩干（3 000r/m，3min），最后用1mL 二氯甲烷洗脱。洗脱液加入内标储备液3μL后在50℃ 水浴中空气流下吹干，残渣用50μL 甲醇溶解，取10μL进样。

1.3.2  色谱条件

采用LiChrospher® 100 RP-18e （250mm×4.0mm，5μm）色谱柱；二极管阵列检测器，检测波长为230nm和250nm，同时进行紫外扫描；柱温50℃；流动相A  甲醇：水：三乙胺缓冲液=50：46：4，流速0.80mL·min-1；流动相B  甲醇：水：三乙胺缓冲液=75：16：9，流速0.60 mL·min-1。

2 结果与讨论

2.1 色谱分离 

在选定的HPLC条件下，药物色谱峰都得到了良好的分离。

提取的空白尿样在两个色谱条件下不干扰药毒物测定，见图1。

兴奋剂类分析方法系列讲座（13）(下)HPLC同时分析尿中39种药毒物

2.2        线性关系

以药物峰面积与内标峰面积之比（Y）对样品中药物浓度（X）作图，得39种药毒物的回归方程和相关系数，各药物的线性良好，相关系数在0.9977以上。

2.3        精密度和回收率

分别加药毒物储备液配成高、中、低三个浓度的尿样，按样品处理方法操作。每个浓度一天同一次操作中分析5份，得天内精密度；不同天内各分析1份，分析5天，得天间精密度。同时将相应理论浓度的标准溶液进样10μL，对应的色谱峰与内标峰面积比之比为绝对回收率，见表1









2.4 检测限

取不同量的各组药毒物，挥干溶剂甲醇，加尿1mL，按样品处理方法操作。在信噪比为3时，哌唑嗪、氟西泮、马钱子碱、奋乃静、异丙嗪、氯丙嗪、氯普噻吨、三氟拉嗪、罂粟碱、蒂巴因、氯氮平、那可汀、丙咪嗪、阿米替林、泰尔登的检测限为1ng·mL-1，氟硝西泮、安眠酮、氯喹、多虑平的检测限为2ng·mL-1，氯硝西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、苯海拉明、布比卡因的检测限为3ng·mL-1，普鲁卡因、三唑仑、克仑特罗、替马西泮、地西泮、美沙酮、氟奋乃静的检测限为5ng·mL-1，苯妥因钠、导眠能、戊巴比妥、吗啡、O6-单乙酰吗啡、可待因、O3-单乙酰吗啡、福尔可定的检测限为15ng·mL-1。

2.5 讨论

2.5.1  流动相的选择  由于药物涉及面广，种类多，在HPLC中的色谱行为有很大差异，很难用同一色谱条件进行分析。曾考虑采用梯度洗脱，但由于甲醇含量需以较快速度增加，基线漂移严重，不宜采用，因此，决定采用两个分析流动相。甲醇含量较低的流动相A用来分析酸性、中性、两性和弱碱性药物；甲醇含量较高的流动相B用来分析碱性药物。

2.5.2  尿样用磷酸盐缓冲液调节pH后上样，结果加入pH=6和pH=8的磷酸盐缓冲液后空白的杂质增多，加入pH=7的磷酸盐缓冲液后与不加缓冲液差别不大，因此选择将尿样直接上样。

2.5.3  用不同的溶剂作为清洗液，观察药毒物与尿中杂质的保留情况。水，各种pH的磷酸盐缓冲液，含5%甲醇的水溶液，含2%醋酸5%甲醇的水溶液，含2%氨水5%甲醇的水溶液及石油醚、环己烷、正己烷、乙醚、庚烷、苯等。通过选择清洗液的种类、调整配比和洗脱顺序，最后选择依次用1mL 2%氨水5%甲醇的水，1mL 5%甲醇的水清洗，既能较好的去除杂质，又能较好的保留药毒物。

2.5.4  洗脱液采用多种单一和混合溶剂，发现甲醇，丙酮，异丙醇，乙酸乙酯，甲醇/二氯甲烷，异丙醇/二氯甲烷作为洗脱液，药毒物可得到很高的回收率，但也洗出了大量杂质；乙醚，正己烷，苯，不同配比的正己烷/二氯甲烷作为洗脱液，空白干净，但有些药毒物的回收率很低；二氯甲烷既可使药毒物保证较高的回收率，洗出的杂质又较少，因此选其作洗脱液。在洗脱液中加入醋酸或氨水，使洗脱液的选择性增强，某类药物回收率会有提高，但另一类则会下降，不利于同时提取尿样中的多种药毒物。

2.6  应用

本方法应用于一例自杀案例的分析，快速从尿中检出多虑平成分，为抢救过程争取到时间并提供了可靠的依据。