声明:我是新手,错误和疏漏之处请各位多多指教!因为要同时进行多项实验,以及受条件限制,更新的可能较慢,敬请见谅!由于不知道怎么上传图片,很多图片还得等学会了再传。因为涉及到保密,本贴会省略一些不必要的细节。感谢月旭工程师的宝贵建议和耐心指导!=======================================================================
导读:
因为第一次发帖没经验,没有及时占用楼层,导致很多内容在后面,看起来不是很连续,幸亏版主使用“乾坤大挪移”征用了沙发了板凳,这里表示感谢!将来的补充多数会更新到前三层,如果未及时更新,请关注后面的帖子
本帖包括九部分内容:
一.背景
二.样品介绍
三.用到的色谱柱和色谱仪
四.曾经的思路(即作为一个新手的“蒙”)
五.咨询月旭工程师后的思路
六.同样流动相,两个色谱柱的比较
七.确定色谱柱,进行流动相的优化
八.峰纯度的检验(目前大概进行3/5,续文目前在50楼,写完会挪前面来)
九.找到的有用的参考文献(目前在15楼)=======================================================================
一.背景 我的研究课题是从发酵液中提取一种小分子抗生素,并得到其纯品。在这个过程中,想用高效
液相色谱帮助指导分离,最终开发出用于测定发酵液效价的方法。要达到这个目的,首先要找到一种合适的分析方法,可以将目标组分与其它杂质分开,并优化到合适的保留时间和良好的峰型。这其中有一个很大的困难:没有目标组分的纯品,不了解其结构。在这种情况下,如何选着色谱柱?如何配比流动相?这一切都是摆在我这个新手面前的挑战。希望此贴能给像我一样刚开始接触HPLC的战友一些经验。
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二.样品介绍 我的目标成分(发酵液中的活性成分)是一种
小分子抗生素,到目前为止对它有以下了解:
1.这是一种小分子物质
2.这种物质极性很强,不溶于绝大多数有机溶剂
3.这种物质在酸性条件下带正电荷,可能呈碱性 在进行高效
液相分析之前,发酵液已经经过了预处理,并用大孔树脂、离子交换树脂等在生物显影的指导下进行了初步的分离纯化(
事实上到这可能很多朋友都看出来了,这种物质在发酵液里,说明它溶于水的。可以用离子交换,就是能电离,那么一定极性不低。如果是行家,可能就不会像我傻乎乎的还用C18+甲醇水摸半个月条件了^-^ )。用于上样的样品组成应该不是特别复杂,推测只有一个活性成分,另外活性成分和杂质应该极性都较强。
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三.用到的色谱柱和色谱仪 1.某品牌C18柱,5μm,4.6×200mm
2.极限C18-AQ,5μm,4.6×250mm(Ul
timate柱试用体验)
Agilent 1100 series,在线脱气机,手动进样器 VWD检测器
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四.曾经的思路 我主修的专业和仪器分析相去甚远,也没有接触过HPLC,这次要完成这个任务,起初还是很盲目的。我们实验室有安捷伦1100高效
液相色谱仪,配备手动进样器和VWD检测器。第一天站到这台机器面前,简直不知道从哪下手,哪个部分是干什么的也不清楚。于是就找到了当地的安捷伦销售(很幸运这销售是我校友),去图书馆借书,查资料,打安捷伦客服电话
(这个客服真管用,态度好,讲解细,建议大家多打),请学校老师帮忙,总算是初步上手了。学会使用色谱仪后,就遇到了第一个问题,选择合适的色谱柱。
如何针对我这个样品选色谱柱呢?说实话,当初看到品牌众多,编号各异的色谱柱时都蒙了,让我自己选是不可能了,于是找到了老师和卖色谱柱的工程师。打听了一大圈之后
最终得到的建议是用一根C18柱(现在看这可能也是在蒙,是一种通用的做法,因为大部分的分析都是在C18上完成的),于是就买了某品牌C18色谱柱一根,装到色谱仪上,满心欢喜之时,遇到了第二个问题,选择流动相。
说来惭愧,开始连流动相的概念和有机溶剂(比如乙腈)的概念都分不清。也是到处打听,最后买了乙腈和甲醇,选择了最常用的
流动相:有机溶剂-水体系。 这些都有了之后,便开始了尝试。如果要用一个词来总结这些尝试,那就是:
失败。有强吸收的地方大多在死体积里。最后甚至用了纯水作为流动相(洗脱能力最弱),依然不能得到很好的效果,愁啊。
下图是用纯水做流动相得到的色谱图乍一看图可能还是可以的,但比较分析之后发现我的目标组分应该是那个2.4分钟左右出峰的。对于一根200mm的柱子来说,这段可能处于死体积的边缘,干扰很多,对以后的定性定量都不利。所以彻底放弃了这种最常规简单的有机溶剂水体系,开始寻求别的办法。
另外想说说很多讲HPLC的书里带的方法开发流程图。因为我刚开始学习HPLC,见到书上的这个流程图时如获至宝,但是仔细一看却心灰意冷。对于一种未知物质,很难用这个图来开发。首先一个分子量大小就得我猜半天,然后是极性还是酸碱,都很难判断。更何况让一个没有经验的人看,这图本身就很难理解。所以我觉得对于新手,又是未知物质,还是先咨询下有经验的人,然后踏踏实实的慢慢开发,在这个过程中就会增长自己对HPLC的理解,找到合适的方法。(再想想如果是已知物质,那可能都有现成的方法,多查查文献就好了)。总之个人觉得那个图可能对于有经验的人更有意义。