主题：【转帖】蛋白质组学的标准化

当面对复杂样本时，自下而上的方法有几种局限性。首先，由于蛋白质浓度具有非常宽的动态范围，故质谱不能检测到所有的多肽离子，因此自下而上的方法本身倾向于检测丰度较高的蛋白质。第二，复杂体系中酶解肽的数量巨大，而分析中的质谱的谱图采集速率(duty cycle)有限，减少了低丰度多肽的采集重现性。第三，多肽异构体(如翻译后的修饰)信息会丢失。最后，自下而上实验中大量的不确定因素会降低实验室内部和实验室之间分析的重现性。表1归纳了各种不确定因素。


由于大量的不确定因素和大多数实验室中缺乏专家，早期蛋白质组学研究中数据的质量较差，并且由于较差的数据重现性致使该领域的名誉不太好。在过去的几年中，一些组织在蛋白质组学标准化协议和提供参考样本方面做出了努力。表2列出了其中5个组织机构及其网址。“发现中的方向”这一部分将对每个发起的组织和计划进行回顾。
ABRF蛋白质组学研究组

　　生物分子资源实验室协会(ABRF)是一个由约1000个成员组成的成员组织，这1000个成员分别代表政府部门、学术领域、研究领域和工业领域的250多个核心实验室。ABRF组织支持13个活跃研究组，成立这些研究组是为了对用于核心实验室的技术进行评估。蛋白质组学技术的三个核心小研究组为：蛋白质组学研究组(PRG)、蛋白质组学标准化研究组(sPRG)和蛋白质组学信息学研究组(iPRG)。



蛋白质组学研究组：PRG的目标是促进对蛋白质现代分析方法的认识和培训。该小组的主要活动为组织每年一届的研究学习，对现行的技术和能力进行考核。每年PRG提出一个特定的蛋白质组学分析问题，发放一个样本分析项目，该项目面向全球ABRF成员，并向成员外的研究者开放，项目发放遵循“先到先得”的原则。样本通常在秋末进行分配，实验结果以匿名方式及时提交给PRG，PRG再对数据进行整理并在次年2月至3月举行的ABRF年会上以报告的形式提交数据。样本由PRG成员组织制备，并由经验丰富的成员实验室进行分析，以确保样本质量。样本列表和过去四年中PRG进行的相关分析任务列于表3。

蛋白质组学标准化研究小组：蛋白质组学标准化研究小组的任务是促进、支持开发和使用蛋白质组学的标准，允许ABRF成员和成员实验室评估他们生成可预测的、和一致性的结果的能力。技术标准包括参考物质、数据组、实验条件和步骤。与PRG类似，sPRG每年将样本分配给ABRF实验室以及合作研究的成员外研究者。表4 列出了最近三年的合作研究题目、样本和分析任务。

蛋白质组学信息学研究组

　　蛋白质组学信息学研究组的任务是教育蛋白质组学研究实验室最大程度地应用和实践生物信息学方法，向精确和复杂的蛋白质组学数据分析方向发展。iPRG积极地支持和参与开发和提高新的算法、软件工具以及蛋白质组信息学战略，目标是向全体会员教育和介绍这些新技术。iPRG已经发起了两个合作研究，一个在2008年另一个在2009年。第一项研究评价了参与者在单个质谱数据组中鉴定复杂混合物中蛋白质的能力。需要特别指出的是，这项研究使得参与实验室使用生物信息学工具，从通用数据集和通用参考数据库中，完成和合并蛋白质鉴定的结果，从而评估使用生物信息学工具的作用。2009年的研究评价了参与实验室测定两个复杂样本间蛋白质显著差异的能力。他们提供了代表每个样本的5个技术复制品的数据组，使参与者能够测定出这些差异的重现性。

生物参考物质自发组织

　　生物参考物质自发组织(BRMI)是英国国家生物标准品和控制研究所(NIBSC)和伦敦帝国理工学院蛋白质组学中心的合作组织。BRMI将通过完成一个历时三年的项目，建立人体器官、组织、细胞和体液的标准物质，用于蛋白质组学方法的标准化，并进行培训。最初的目标是开发用于二维凝胶电泳的参考物质。在第一阶段将建立人类血浆参考物质(PRM)，PRM依据世界卫生组织(WHO)国际标准建立，来源于储存在NIBSC的冻干人类血浆。在NIBSC 和皇家理工学院间的PRM分析的重现性将首次被评定，之后，标准物将用于其它蛋白质组学实验室。BRMI将与HUPO蛋白质标准组织合作收集和分析数据。BRMI在第二阶段将会进一步研究其它参考物质，这些参考物质将具有细胞-组织-器官特异性。
癌症临床蛋白质组学技术评价组织

CPTAC是癌症临床蛋白质组学技术自发组织(CPTI)的三个重要组成部分之一，是2006年由美国国家癌症研究所资助的五年计划。CPTAC自发组织的目标是建立那些用于癌症诊断、治疗和预防的先进蛋白质生物学的技术、数据、试剂、参考物质以及分析系统的基础。CTPAC建立了表6列出的五个团队的合作网络。这五个多元化的小组是根据他们蛋白质组学的专业经验和技术水平挑选出来的。这些小组的研究目标列于表6。自合作之日起，CTPAC已经建立了8个工作组研究蛋白质组学研究中所关心的特定问题(见表7)。在这些工作组中，最活跃的一个是无偏见的发现工作组(Unbiased Discovery working group)，这个工作组的工作任务是为故障排除、记录系统的性能以及建立系统适应性提供量化指标。对由NIST分配的20个蛋白混合物的最初研究显示，参与实验室之间存在着广泛的差异性，他们已经做出了努力去找出不确定因素的来源。接下来，将酵母蛋白组作为一个评估不确定性和建立标准操作规程(SOPs)、协议及建立减少不确定性方法的复杂样本。线性离子阱质谱(LTQs，赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)或LTQ Orbitrap系统被选为LC–MS平台的基础设备。采用44个系统性能量化指标来监测平台的单个元素。这些指标可被分为几组，依据色谱的性能、MS1 (母离子)信号、MS2(碎片离子)信号、动态采集和多肽鉴定。[5]多个实验室在量化指标上的不同可指示出：哪一个系统组件对于标准化是最不利的。对实验室间上述量化指标的监控，绘制了“仪器健康图”来识别何时性能失控。[6]使用上述量化指标来表征LC–MS-MS的性能将为实验室表现指标、改善方法及评价新技术方面提供依据。


　CPTAC“目标性验证”工作组正在利用液相色谱-多反应监测质谱(LC–MRM-MS)来评价血浆中蛋白质定量性能的研究。[7]上述多个实验室的研究正在鉴定不确定因素的来源，同时利用美国应用生物系统公司(福斯特市，加利福尼亚)的Q-Trap和Thermo的Quantum三重四极杆质谱，来研究LC–MRM-MS分析多肽时的性能特点。

　　蛋白质组学固定运动

　　固定蛋白质组学是一个基于网络、非商业的、依靠技术的运动，致力于解决实验方面、阻碍蛋白质组学发展自己潜能方面的挑战。这一运动围绕网站( http://www.fixingproteomics.org/)展开，并通过该领域一些要人的志愿捐助而发展。这一运动由10个创始人发起，其中3个来自产业界，7个来自学术研究所。这一网站的主要面向二维凝胶电泳。

　　固定蛋白质组学为如何实现跨实验室结果重现性方面提供了可行性建议，跨实验室重现性包括一个蛋白质固定四步法和HUPO重现性研究规程。四步法包括：实验设计、用多个生物复制品进行试验、在实验室内部确认试验的结果，以及确认其是否具有跨实验室的重现性。对于四步法的详细介绍包括在数据分析过程中出现的问题和定量蛋白质组学实验设计两个方面的问题。还包括两个商业化蛋白质组学标准方面的信息、蛋白质质谱通用蛋白质组学标准(西格玛奥德里奇，圣. 路易斯，密苏里州)和HUPO黄金质谱蛋白标准(英杰生命技术公司，加利福尼亚)。

　　固定蛋白质位点的特征是制定详细的蛋白质组学实验规程。包括利用一维聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和串联质谱分析蛋白质混合物的规程;二维凝胶电泳(2D PAGE)前细胞和组织的制备规程;2D PAGE的通用规程，并且，诺华制药生物医药研究所正在制定利用二维凝胶电泳分析海拉(Hela)细胞标准规程。这一网站同时展示两个关于二维凝胶电泳重现性研究的报告，报告介绍了五个实验室分析一对流感嗜血杆菌溶解物的结果。这一站点还提供一些出版物的链接，包括研究论文、国内和国际会议的海报(Posters)以及《科学》、《自然》等期刊中与固定蛋白质组学运动有关的报告。

　　固定蛋白质组学网站的设计是互动的，登录站点的浏览者被邀请提供反馈并对与蛋白质组学和可能的解决方案有关的问题提供相关信息。

人类蛋白质组研究组织


　国际人类蛋白质组研究组织(HUPO)成立于2002年，其成立的目的是搭建蛋白质组学的应用框架，从而解决生物医学方面的问题。这一组织由11个独立的项目组成，每一个项目主要由一个国家实施，并针对一个特定器官或蛋白质组研究一个方面的问题进行研究(见表8)。蛋白质组学标准化组织(PSI)的任务是制定蛋白质组学数据表示的标准，以利于数据的对比、交换和验证。蛋白质组学实验必备最少信息(MIAPE)制定了一个规范，指导如何来充分报道一个蛋白质组学实验，并为期刊和数据保存者提供需求。PSI目前分为6个工作组，每个工作组关注一种特定的蛋白质组学技术。


HUPO新技术和资源委员会的任务是培训和教育，而PSI的工作核心在于编制文档。PSI这一组织独立开展工作，目前正在开发用于多个实验室间合作研究的测试混合物。蛋白质鉴定的定性研究是制备测试混合物的第一步，这项任务已经完成且已公开。该项目的第二步将是制备一种评估定量方法学的混合物。

　　结论

　　近十年早期，蛋白质组学已成为一个备受关注的研究领域，蛋白质组数据的质量和重现性日益引起人们的关注。在这期间，质谱仪在性能和耐用性方面已取得了长足进步。伴随质谱技术发展的，还有样品制备技术、分离技术以及生物信息学软件技术。蛋白质组学各种工具的协同提高，促使人们越来越重视实验步骤的标准化和提供测试样本，这样可使蛋白质组学实验室评估和提高他们的专业技能。

看来挺复杂的事情，不是简单的蛋白质含量的问题了

这个比较专业哈，自然科学有太多的需要探索的空间了……

原文由 testeen(testeen) 发表:
这个比较专业哈，自然科学有太多的需要探索的空间了……

微观和宏观是两个发展方向

好复杂呀,只想知动物蛋白质和植物蛋白质那个好一些.