原文由 liu22spoh(liu22spoh) 发表:
先谢谢各位发言的大侠们!
这几天我就在做这个试验,不知道那是啥荧光物质。
之前没听说过荧光3d扫描,呵呵,还望各位告知一下都有那些品牌的相关仪器。
昨天用激发和发射光谱(300-700nm)的方式来做,发现问题很不少。
1,先在分光光度计上,检测全波长吸收曲线,发现在560nm处有最大的吸收峰,其他波长处基本上没有吸收,这是不是说明这个荧光物质的最大激发波长为560nm呢?
2,我权且把它的最大激发波长当作560nm,结果发现,检测发射光谱的时候,510nm-610nm这个范围之内的发生光均特别大,而峰值依旧在560nm,这是什么原因呢,因为反射光没有被屏蔽掉?我以490nm作为激发光,检测FITC的发射光谱,发现还是490nm两边的发射光信号呈正态分布。
3,为了确保仪器的有效性,我拿FITC做了一下扫描,以700nm作为发射光时,最大的激发波长为490nm;而以750nm为发射光时,最大的激发波长却不是490nm,偏差还蛮大的,这是什么原因呢?
还望大家不吝赐教啊!
未知样品测试选定激发和发射的最佳位置,需要一定的判断力。如果采用3D扫描当然是一个很好的快捷方式了。
如果没有呢?主要是经验了。
对于这位老兄的问题,主要是对荧光光谱仪的基本原理不明确。
1.最大 吸收峰并不代表激发峰-----因为不是吸收就能导致激发。但是吸收峰一定是可能的激发位置。
2. 测量荧光光谱----设定发射谱范围是需要回避激发波长位置的。所以你无法得到荧光峰,可能是被激发的一阶散射的强度掩盖了。
3. 不明白校正有效性的理由。
所以:这个方法来选取理由合理,方法需要细心考虑。主要是第二步的问题。