1.凝胶的预处理
交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒,使用前必须充分溶胀。方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5~10倍的去离子水中,参照相关资料中凝胶溶胀所需时间,进行充分浸泡,然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒,并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡,准备装柱。在许多情况下,也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀,此法不仅能加快溶胀速率,而且能除去凝胶中污染的细菌,同时排除气泡。
表 凝胶型号和层析柱大小与规格及凝胶用量
层析柱规格 | 凝胶的规格和用量(g) |
直径(cm) | 高(cm) | 容量(ml) | G25 | G50 | G100 | G200 |
0.9 | 15 | 9.5 | 2.5 | 1 | 0.6 | 0.3 |
0.9 | 30 | 19 | 5 | 2 | 1.2 | 0.6 |
0.9 | 60 | 38 | 10 | 4 | 2.5 | 1.2 |
1.6 | 20 | 40 | 10 | 4 | 2.5 | 1.2 |
1.6 | 40 | 80 | 20 | 8 | 5.0 | 2.4 |
1.6 | 70 | 140 | 35 | 14 | 9.0 | 4.4 |
1.6 | 100 | 200 | 50 | 20 | 12.5 | 6 |
2.6 | 40 | 210 | 50 | 20 | 12 | 7 |
2.6 | 70 | 370 | 90 | 35 | 20 | 12 |
2.6 | 100 | 530 | 130 | 50 | 30 | 17 |
2.装柱 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时,柱床体积应为样品体积的25~100倍。去除盐及游离荧光素约为样品体积的4~10倍。柱太短,影响分离效果。柱长一些,分离效果好,但柱太长,则延长分离时间,样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细,会发生“器壁效应”,即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5~1︰25;对于纯化蛋白质来说应为1︰20~1︰100。
凝胶柱的装填方法和要求,基本上与离子交换柱的制备相同。一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致,没有空隙和气泡。通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后,将带色的兰葡聚糖–2000、细胞色素,或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱,观察色带是否均匀下移,以鉴定新装柱的技术质量是否合格,否则,必须重新装填。