美国CDC实时RTPCR(rRTPCR)检测猪流感操作规程(2009版)
本规程所有权归属疾病控制中心,紧急状态时授权各公共卫生实验室使用。本规程不用作商业活动或赢利目的。
一、概 述
(一)前提
本规程基于对rRT-PCR方法的基本掌握。
(二)实验原理实时荧光定量RTPCR(rRTPCR)法检测猪流感的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan®探针,对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定性检测鉴定。InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计,swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒,swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的呼吸道样本。
(三)使用条件
一步法定量RT-PCR 96孔板热循环系统。
(四)生物安全要求样本处理应在相应的生物安全实验室完成。
(五)样本要求1、呼吸道样本支气管肺泡灌洗液,气管抽吸物,痰,鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质(如聚脂或涤纶)、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。
2、排除标准1)未在2-4°C (≤4 天)或-70°C及以下保存的样本
2)以上未列的其它不当样本
(六)核酸提取RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。RNA提取操作需经过检验核酸的纯度合格之后,再用于样本实验。商业化的操作程序中包括QIAamp® 病毒RNA提取试剂盒,RNeasy®小试剂盒 (QIAGEN公司),罗氏MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒, MagNA Pure
$$lc RNA分离试剂盒II, 和罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒,在推荐的操作程序下,可提取高纯度的RNA。
(七)免责声明:提到的厂家名仅用作举例,并不表示疾控中心认可。