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主题：定量PCR仪的原理是什么？

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发表于：2006/09/10 07:26:00 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

在我概念里PCR就是程序控制升温和降温，主要指标是升温降温的速度和温度的准确性，请哪个给介绍一下定量PCR到底是怎么一回事？

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2006/9/12 14:29:00 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

我也想知道,期待高手

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2006/9/15 9:55:00 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

转载自丁香园
chel

Posts: 3
Score: 2
2003-07-30 11:22
--------------------------------------------------------------------------------

荧光实时定量PCR技术最早是在1992年由日本科学家Higuchi第一次报告提出的。该技术自产生以来不断完善，到目前为止已经相当成熟了。其采用多种全自动荧光定量PCR仪，如：ABI GeneAmp® 5700、ABI PRISM® 7700、7900HT、LightCycler®和iCycler等，是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR根据所使用的荧光化学可分为荧光探针和荧光染料两种。现较常用的是TaqMan荧光探针技术，它具有高特异性和可靠性，实验结果稳定且重复性好。其原理简述如下：

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团（Reporter）和一个淬灭荧光基团（Quencher）。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－>3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

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2006/9/15 9:56:00 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

再给你一个网址
也是转载自丁香园
pox

Posts: 20
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2005-07-08 07:38
--------------------------------------------------------------------------------

Real Time PCR Primer and Probe Database

http://medgen.ugent.be/rtprimerdb/

RTPrimerDB is a public database for primer and probe sequences used in real-time PCR assays employing popular chemistries (SYBR Green I, Taqman, Hybridisation Probes, Molecular Beacon) to prevent time-consuming primer design and experimental optimisation, and to introduce a certain level of uniformity and standardisation among different laboratories.

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2006/9/15 10:10:00 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

这个或许对你也有用
http://www.instrument.com.cn/show/download/shtml/029754.shtml

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hclo

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2006/9/16 10:57:00 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

谢谢，我也知道了

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2006/9/17 20:52:00 6楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

谢谢了，有了个大概的概念！

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yanfliu

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2006/9/18 16:05:00 7楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

非常感谢的说

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muyihaoran

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2006/9/20 13:45:00 8楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

PCR技术的基本原理

　　　　PCR技术的基本原理　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

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2006/9/20 13:46:00 9楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

PCR的反应动力学　 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

　　PCR扩增产物　可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3' 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

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muyihaoran

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2006/9/20 14:08:00 10楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。在国家没有出台阴阳判定标准时，所用PCR系统灵敏度最好达到一个拷贝（一个病毒）。从理论上说，只要有一个拷贝数，样本就算阳性；一个拷贝数都没有才算阴性。