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一、总RNA 提取
总RNA提取是分子生物学实验中常见的技术步骤,用于从细胞或组织样本中分离和纯化总RNA。以下是一个常见的总RNA提取流程及注意事项:1、 一切使用器材(各种类枪头,ep管等)均需要无酶。可直接购买无酶器材或将器材在实验前一天浸泡于DEPC水中过夜,烘干使用。2、 整个操作过程最好在冰上进行。l 实验步骤:1. 将细胞培养液倒掉,立即加入Trizol试剂,每瓶1ml,反复吹打,室温静置5-10min;2. 将细胞吸入1.5ml EP管中,每管加 入200ul氯仿,旋窝振荡器剧烈震荡15s,冰上孵育5min;3. 4℃、12000g离心15min,收集上层无色水相到新的1.5ml EP管中(此处离心后ep管中会分为3层,上层透明:RNA;中层乳白:DNA;下层红色:蛋白及细胞碎片,收集上清液切记不可贪多,切勿将DNA误吸)4. 加入等量异丙醇(约500ul),轻柔颠倒混匀(沉淀RNA);5. 4℃、12000g离心15min,弃上清;6. 加入1ml 75%乙醇并震荡(将沉淀弹起即可,乙醇要用DEPC水配制,若提取miRNA建议乙醇浓度为80%,洗涤效果更好);7. 4℃、12000g离心5min,弃上清;8. 空气中(超净台内)干燥20-25min;9. 加入20-30ul DEPC水溶解RNA;10. 分装后,-80℃保存。
二、逆转录(包括miRNA逆转录)a) 总RNA逆转录RT master mix | 4ul |
总RNA | 2000ng |
Rnase-free water | 补足至20ul |
[img=,43,]file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/ksohtml12932/wps1.png[/img][img=,43,]file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/ksohtml12932/wps2.png[/img]
反应条件:37℃---15min 85℃---5s 4℃---end逆转录结束后cDNA可以长期保存于-20℃。b) miRNA逆转录(加尾法)RT solution mix | 10ul |
Enzyme mix | 2ul |
总RNA | 2000ng |
Rnase-free water | 补足至20ul |
[img=,43,]file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/ksohtml12932/wps3.png[/img][img=,43,]file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/ksohtml12932/wps4.png[/img]
反应条件:37℃---60min 85℃---5min 4℃---end逆转录结束后cDNA可以长期保存于-20℃。