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主题：【第十七届原创】免疫荧光protocol和细胞台盼蓝染色计数实验操作步骤

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Ins_564515b5
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发表于：2024/10/08 22:08:13 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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免疫荧光



1.固定：4%多聚甲醛500ul/孔，室温固定30min；

2.酸处理：吸出4%多聚甲醛，用PBS润洗一遍，加入含2mol/L HCl 的PBS溶液500ul/孔，室温1h（此步骤仅BrdU需要）；

3.透膜：吸出HCl,加入透膜液500ul/孔，37℃，1h；

4.封闭：封闭液（1%BSA,5‰tritonX-100的PBS溶液）室温，1h；

5.一抗过夜：一抗：封闭液＝3ul：500ul,4℃过夜；

6.一抗回收：EP管4℃保存；

7.一抗清洗：清洗液（1‰ TWEEN20,0.1‰tritonX-100的PBS溶液）500ul/孔，37℃，120rpm, 5min x 3；

8.二抗孵育：二抗：清洗液＝1 ：2000, 预混，避光，37℃，150rpm, 5min ；

9.二抗清洗：同一抗；

10.DAPI染色：DAPI ：清洗液＝ 1 ： 100 , 37℃，10 min ；

11.DAPI清洗：同一抗；

12.封片：擦净载玻片，滴上1滴抗抗荧光淬灭剂，吸净孔板里的液体，取出爬片倒放在载玻片上，中性树脂封片，待树脂干后可置于导航仪上观察；

13.观察后切片置于切片盒，4℃保存。

贴壁细胞：  直接将细胞接种于爬片上，待细胞长至合适密度进行免疫荧光。

悬浮细胞 ： 提前用500ul 1%PDL处理爬片（37℃，30min）,然后在细胞传代重悬后取30万细胞/400ul培养基接种于每张爬片上，细胞培养箱中放置2h后进行免疫荧光实验。

●台盼蓝染色

一．实验原理：细胞损伤或死亡时，台盼蓝染料可以穿过变形的细胞膜与解体的DNA结合，使其着色。而活细胞能阻止这类染料进入细胞内。

二．实验步骤：

1.用75%酒精擦干净计数板，放于超净台内；

2.准备稀释好的细胞悬液，取90ul于EP管；

3.取10ul0.4%台盼蓝加入EP管（此时台盼蓝浓度为0.04%）；

4.用100ul枪吹散混匀台盼蓝与细胞悬液；

5.取10ul加入计数板；

6.10X镜下数细胞总数以及台盼蓝蓝染的细胞数；

7.计算：细胞活性=（1-台盼蓝蓝染的细胞个数/细胞总数）X100%；

三．注意

台盼蓝染色后，应迅速进行细胞计数，不超过3min，否则部分活细胞也会着色，从而干扰计数，影响实验的准确性；
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