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主题：【第十七届原创】孔板琼脂成球分析（反映单个细胞的生长）

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Ins_564515b5
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发表于：2024/10/08 22:16:19 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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孔板琼脂成球分析（反映单个细胞的生长）

 

（一）实验材料：LLC-ASD细胞 琼脂粉 超纯水 含5%FBS的DMEM培养基(含抗生素) 超净台 漩涡振荡仪 倒置显微镜





（二）基本步骤：

(1)制单细胞悬液：

收集对数生长期的LLC-ASD细胞，计数后用含5%FBS的DMEM培养基极限梯度稀释得5ml 1×103个/ml，剩余的细胞重新收集，以便以后做RT-PCR验证实验。

(2)制底层琼脂：

用蒸馏水制备1%的琼脂液，待琼脂液温度刚刚不烫手时，在15ml离心管中加入5ml 1%的琼脂和5ml 5%FBS的DMEM培养基(含抗生素)，迅速用漩涡振荡仪混合均匀，即刻向6孔板中每孔加入1ml混合液，摇匀铺平，待冷却凝固后，作为底层琼脂，置于超净台中备用。

(3) )制底层琼脂：

用蒸馏水制备1%的琼脂液，待琼脂液温度刚刚不烫手时，在15ml离心管中加入4.5ml 1%的琼脂和4.5ml 5%FBS的DMEM培养基(含抗生素)，迅速用漩涡振荡仪混合均匀，再加入1ml 1×103个/ml的LLC-ASD细胞单细胞重悬液，用漩涡振荡仪混合均匀，得含细胞数100个/ml的0.1% 的琼脂培养基混合液。迅速向6孔板中各孔加入1ml混合液，摇匀铺平，待冷却凝固后，即为上层琼脂，                         



(4)加培养基，观察计数：

向6孔板每孔缓慢沿壁加入1ml5%FBS的DMEM培养基(含抗生素)后放入培养箱持续培养8~10天，第4天开始每天在倒置显微镜下检查，到80%以上的细胞形成100个细胞以上的克隆球时终止培养，此时计数形成50个细胞以上的克隆球的数目，作为此孔的克隆球数。

(5)每孔克隆球数除以100，作为此孔克隆率，统计分析。





注意：

1 此实验最重要的是把握好时机，即不可动作过快，使得过热的琼脂液破坏培养基和细胞，又不可动作过慢，使得琼脂过早凝固。

2 用漩涡振荡仪时一定要充分混匀混合液，否则最终单细胞无法固定于琼脂中。具体时间视混合液体积和琼脂比例而定。
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