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主题：【第十七届原创】PCR实验及数据分析和DNA电泳protocol

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Ins_564515b5
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发表于：2024/10/08 22:29:02 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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PCR实验及数据分析

l 实验原理: 聚合酶链反应(PolymeraseChainReactionm,PCR)是一项体外基因扩增技术,是以微量DNA进行目的片段扩增的方法。通过DNA链的热变性、引物退火、DNA聚合酶作用下引物的延伸三个步骤循环往复，可在短时间内扩增DNA达100万倍以上。

l 实验体系:

a) 普通PCR

PCR master mix5ul
Primer mix(10M)0.8ul
cDNA0.8ul
Dnase-free water3.4ul


反应条件  Step1: 95℃    30s

              Step2: 95℃    5s

                        60℃    30s      40cycles

b) miRNA PCR

PCR master mix5ul
F  primer(10M)0.25ul
Universal primer(10M)0.25ul
cDNA1ul
Dnase-free water3.5ul


反应条件  Step1: 95℃    30s

              Step2: 95℃    5s

                        60℃    30s      40cycles

l 数据分析

采用2^-ΔΔCt来表示相关基因表达量，计算方法如下：

例：比较目的基因在A,B两种细胞里的表达量。

1、ΔCtA=Ct 目的基因 – Ct 内参；ΔCtB=Ct目的基因 – Ct内参

2、ΔΔCt=ΔCtA – ΔCtB

由此，目的基因在A细胞内的表达是在B细胞内表达的2^-ΔΔCt倍。

DNA 琼脂糖凝胶电泳



1.胶制备：根据目的片段大小制备相应浓度的凝胶（琼脂糖、1XTAE）;

凝胶浓度0.5%0.8%1%2%
分离片段大小10000-20000bp7000-10000bp500-7000bp100-500bp


2.微波炉加热使琼脂糖完全溶解在TAE中（溶液变清澈）；

3.稍待液体冷却后小心加入EB（100ml/5ul），摇匀，最好不要产生气泡，然后将液体倒入提前洗好的凝胶槽中，冷却30min胶可成型；

4.然后小心垂直拔出插槽，将胶小心取出，置于电泳仪内，电泳仪内加入1XTAE将胶淹没；

5.上样：将样品与5x loading buffer混合均匀后小心加入点样孔，在最后加入marker；

6.盖上盖子，检查电泳仪，注意应保持凝胶的起始端与电泳仪黑色线端一致；

7. 120V, 50min;

8.电泳完后，取出凝胶，置于凝胶成像仪成像。



注意：EB是强致癌物，实验过程中必须带PE手套，使用完后的胶及垃圾一定及时清理。

1x TAE由50x TAE稀释而来

50X TAE配置：以配制1L为例

Tris Base 242g ，冰乙酸57.1ml，0.5M EDTA(pH=8.0)100ml置于1L 烧杯中，加入去离子水，混匀，待完全溶解后用去离子水定容至1L，室温避光保存。
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