主题：【第三届原创参赛】【日立L-2000】<参加天美公司原创大赛>黄曲霉毒素的测定-反相液相色谱荧光直接测定法（10月）

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xiaoyuer

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发表于：2010/10/14 14:25:16 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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黄曲霉毒素的测定国家标准方法有很多种，有采用柱后试剂衍生反相液相色谱荧光法、柱前衍生反相液相色谱荧光法、酶联免疫吸附法、薄层法，柱后试剂衍生需要添加柱后衍生用液相泵、反应盘管等，柱前衍生重现性相对较差且操作麻烦，酶联免疫及薄层相对准确性较差，本文采用常规四元梯度反相液相色谱配L-2485荧光检测器直接测定黄曲霉毒素，操作简单、灵敏度较高。

1仪器与试剂

HITACHI L-2000高效液相色谱仪、配L-2485荧光检测器，各种试剂均为色谱纯或分析纯，实验用水为超纯水，免疫亲和柱Alfa Test（VICAM），黄曲霉毒素对照品均为SIGMA标准品。样品为市售玉米渣。

2色谱条件

色谱柱：Hitachi LaChrom C18 (5μm)4.6mmI.D.x250mmL.

流动相：CH₃OH：H₂O =45:55

流速：0.8mL/min

柱温：30℃

波长：E_x：365nm E_m：435nm

进样体积：20µL

3样品前处理

准确称取25克样品加入125mL甲醇水（7:3）溶液，加入5克氯化钠，振荡溶液30min，纤维滤纸过滤，移取10mL滤液，加入10mL水，将溶液过免疫亲和柱，用20mL超纯水淋洗，用真空泵抽干柱，加1mL甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，加水1mL，过0.45μm滤膜，作为待测样。

4 结果与讨论

4.1标样的测定

在选定的条件下四种常测黄曲霉毒素得到很好的分离，其中B1、G1的灵敏度比B2、G2低。

图1黄曲霉毒素标样色谱图

（浓度B1、B2、G1、G2=7.5、4.2、8.5、3.5ng/mL）

4.2实际样品的测定

玉米样品及玉米加标样品采用免疫亲和柱净化后测定，回收率在80-110%之间（其实验结果如图2）。

图2玉米样品、玉米加标样实验叠加图

A：玉米样品 B：玉米加标样

4.3最低检测限

将标样稀释，在S/N=3的时候得到最低检测限，其结果如图3，荧光检测器可以选择PMT电压，PMT电压越高，整体的灵敏度就越高，图3中A为采用中等电压时候的色谱图，B为采用超高电压时色谱图，从图可以看出，超高电压时的灵敏度约为中等电压时的10倍，对于浓度较低的样品可以选择超高电压值，而对浓度比较大的样品可以选择超低PMT电压值。

图3黄曲霉毒素最低检出限色谱图

（A：PMT=Medium，B：PMT=Super High，浓度B1、B2、G1、G2=0.5、0.08、0.5、0.002ng/mL）

5 结论

采用反相色谱柱分离，直接用荧光检测器检测，操作简单，黄曲霉毒素B1的最低检测限为0.5ng/mL，按照GB/T18979-2003《食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法》中规定方法的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量检出限为1μg/kg，根据前处理方法及加标回收可以的出，该方法完全满足国标的要求，适合于大量样品的常规分析。

附件：

黄曲霉毒素的测定-反相液相色谱荧光直接测定法.doc

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