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主题：【资料】PCR知识分享

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2010/10/21 14:10:41 11楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
8. SSⅢ与SSⅡ有何不同？
*具有更高的热稳定性（达50℃）
*具有更长的半衰期（达220分钟）
*对PCR无抑制
*干冰运输
*Tdt活性更低
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2010/10/21 14:11:05 12楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
9. 为什么有人更喜欢用SSⅢ而不是ThermoScript？

ThermoScript如果保存不当会引起活性很快降低，SSⅢ则更稳定。
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2010/10/21 14:11:25 13楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
10. 为什么使用基因特异性引物（GSP）？
GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物用于mRNA片段的逆转录。

11. 什么情况下需要使用RNase H？
在第一轮PCR中RNA/DNA杂合体不能正常变性时
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2010/10/21 14:11:56 14楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
12. 根据不同的目的选择不同的系统：
目的 建议
RT与PCR使用不同的引物
或需要灵活选择PCR DNA聚合酶 两步法RT-PCR系统
高灵敏度 一步法或两步法RT-PCR系统
高特异性 含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统
或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系统
高保真度 含有Pfx Taq酶的两步法RT-PCR系统
长的反转录结果 通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果
含Elongase酶的一步法RT-PCR系统
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2010/10/21 14:12:22 15楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
二、Generacer
1. 如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）？
使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求：
*50-70％的GC含量，以提高引物熔点（Tm）
*23-28个碱基长度，以提高引物特异性
*降低3’端GC含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低
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2010/10/21 14:12:42 16楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
2. 为什么得不到RACE产物？
*加入Hela对照
*低质量的RNA模板
*逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成
*目的基因丰度太低，可以通过提高PCR的循环次数来解决，建议使用巢式PCR
*目的基因没有表达，可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因
*目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用GeneRacer试剂盒中的Oligo dT来得到全长cDNA，使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR。
*cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化PCR反应参数及反应体系；降低退火温度；使用5-10％的DMSO帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。
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2010/10/21 14:13:13 17楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
3. RACE的PCR结果有杂带
RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因：
*GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。
*GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。
*RNA降解。
*PCR管或试剂污染。
注意：杂带一般是因为没有优化PCR条件，可以加入阴性对照来确定。
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2010/10/21 14:13:36 18楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
4. 得不到全长的5’RACE PCR产物
*CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5’磷酸的断裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo连接。一定要小心操作，保证RNA无降解。
*CIP脱磷酸不完全，可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。
*PCR产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化PCR。
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2010/10/21 14:14:05 19楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
二、Generacer
1. 如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）？
使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求：
*50-70％的GC含量，以提高引物熔点（Tm）
*23-28个碱基长度，以提高引物特异性
*降低3’端GC含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低
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2010/10/21 14:14:34 20楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
2. 为什么得不到RACE产物？
*加入Hela对照
*低质量的RNA模板
*逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成
*目的基因丰度太低，可以通过提高PCR的循环次数来解决，建议使用巢式PCR
*目的基因没有表达，可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因
*目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用GeneRacer试剂盒中的Oligo dT来得到全长cDNA，使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR。
*cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化PCR反应参数及反应体系；降低退火温度；使用5-10％的DMSO帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。
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