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主题：【求助】求助液相色谱进样品不出峰原因分析

浏览0 回复23 电梯直达
庐山居士
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发表于：2010/10/27 21:12:48 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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一、仪器：Varian HPLC 230泵/325紫外检测器（单波长）、配国产柱温箱、手动进样、Varian C18(5μm，4.6mm×150mm).
二、实验过程：测丹参片中丹参酮IIA溶出度
      1、配系列丹参酮IIA标准溶液（溶剂用85%甲醇），共5个标样，先在紫外分光光度计上进行光谱扫描，峰值检出，在269.3nm有最大吸收峰，再做定量测定，标准曲线相关系数为0.998，溶出介质为稀盐酸，溶出样品按时间点分别取样7个，针筒过滤器过滤，不稀释上紫外测试，30分钟前溶出不明显，测出吸光度值低，30分钟后有明显溶出，吸光度值高，位于标3与标4之间。
 
        下面是标样的及溶出样品的紫外定量测定图:(见17楼的补充贴)

      2、溶出条件不变，溶出样品采用液相进行测试，液相条件：检测波长270nm；流动相：85%甲醇：15%水；等度洗脱，分析时间10分钟；柱温：30度；流速：1ml/min。
      3、取丹参酮IIA标准溶液（溶剂用85%甲醇），共5个标样，分别依次手动进样，进样量100uL(定量环20uL)，标样均在5.4min左右出峰，各标样保留时间非常重合，对照品标准曲线相关系数：0.996。
     
    下面是5个标样的色谱图，色谱图进行了偏置2%，为了利于版友观察，从前往后分别是标1-5：
       
    下面的图是标准曲线图，标1的峰面积有的偏小，但还是基本成线性：

      4、前面实验过程都比较顺利，在预想在范围内，问题出现在最后时刻，开始对溶出的7个时间点样品（直接从溶出杯中取样，溶剂为稀盐酸，针筒过滤器过滤）上HPLC进行测定，怪事发生了，竟然没出有一个出峰的，连一个其它的杂峰都没有，只有开始时的一个溶剂峰。

      下面是7个溶出样品的色谱图，色谱图进行了偏置2%，为了利于版友观察：


      5、原来我们做过丹参片中丹参酮IIA含量的液相测定，方法基本一致，标准曲线比较容易做，样品用85%甲醇超声定容，除了和标样在同样位置出峰外，在这峰之前还有其它成分的峰。

    下面是以前做的丹参片样品及丹参酮IIA标样的色谱图，色谱图进行了偏置2%，为了利于版友观察，前面的丹参片，后面的丹参酮IIA：


      6、我怀疑稀盐酸在其中做怪，于是调整样品配置方法，将第6、7时间点采集的溶出样品各取1mL，用85%甲醇定量到10mL，以图消除稀盐酸的影响，重新配制的第6、7的溶出样品分别进样，结果还是让人晕倒，竟然还是一条直线，除了溶剂峰外，一个峰都没有，跟进一针试剂空白一样，由于今天太晚了，没有再做其它方案调整，于是冲柱2h后走人了，谱图也忘记拷贝了。
   
    下面是用甲醇稀释过的溶出样品6、7的色谱图，色谱图进行了偏置2%，为了利于版友观察：


三、回家后，想想今天真是郁闷啊！本想今天实验十拿九稳，大不了线性不好，但竟然不出峰，让我摸不着头脑，做液相以来，这次让我最纠结，急盼高手指点迷津，万分感谢！

四、第二天调整了色谱条件，同等度洗脱改为梯度洗脱，甲醇由60%梯度到90%，先进了一针标样，看出峰靠后，于是增加了分析时间，又进了一针同样的标样，但结果都让人不满意，标样出峰很怪，标样峰前面的驼峰正常吗？
 
    下面是梯度洗脱方法做的两次标样，两次的分析时间不同，第一针是15分钟，第二针改为了20分钟：




五、再次调整了色谱条件，改变梯度洗脱方式，先前甲醇由60%梯度到90%，改为甲醇由70%梯度到95%，进了一针溶出样品，看是否有出峰？
 
    下面是改变梯度洗脱方法进的一针溶出样品，分析时间是20分钟：


六、问题不但没有解决，反而梯度洗脱又出了让人看不懂的色谱图，第一次梯度的色谱图中的驼峰还可以理解成梯度洗脱使得基线上漂，而第二次梯度的色谱图中驼峰与目标峰中间竟然又多出了一个峰，无法理解，再次陷入了困局，望高手再度出山，来拨云见日，多谢了！

        主贴内容在不断更新，望各位版友能持续观注！！！
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2010/10/27 23:28:34 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
是不是样品出现什么问题？
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chenping0829
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2010/10/28 15:15:02 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
你看当时的泵压没？有可能是根本没有流动相进入色谱柱
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liuyanning
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2010/10/28 21:16:28 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
这个原因很多，用排除法吧兄弟
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有水有渝
xky0230699
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2010/10/28 22:34:04 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
１、怀疑紫外检测到的吸收不是所要组分的吸收，样品也做一个紫外扫描看看。
２、色谱条件不适合，或可能是丹参片的背景物质影响比较大。
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xiaohui9804
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2010/10/29 10:45:24 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
看看溶剂峰变大了没，可能稀盐酸使得样品没有保留了，与溶剂共出峰。
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毛毛虫
acic_zyf
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2010/10/29 14:11:29 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
大致看了下来，个人觉得你样品出问题的可能性较大，一种可能是样品本身存在的问题，而是有可能你配制过程出了问题，建议你先重配样品看看，还是不行的情况下，可以换样品重新配进样试试，总之实验过程中，不能怕麻烦，多次验证下的结果才会有更好的证明度．
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色色猪
huangqining
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2010/10/29 17:08:31 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
大概看了下，LZ的标准品能正常出峰，但是样品是一条直线，标准品和样品的区别只有在溶剂方面，用85%的甲醇做溶剂显然是没有问题的，关键在于盐酸可能对丹参酮IIA的稳定性方面有影响，是不是样品里面加了盐酸导致丹参酮IIA变质了呢？
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〓猪哥哥〓
03yx2
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2010/10/29 20:35:50 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
庐山居士，你好

我觉得可能有几个原因：
1、色谱柱。因为最初使用的是盐酸为基质，对色谱柱可能有影响，更换一根色谱柱再试试。
2、定量环。对于这个问题，更换一个六通阀或者直接更换一台仪器试试。不过这个可能性会比较小，因为原实验出现了溶剂峰。
3、样品问题。把7个样品放入紫外下检测，看是否出峰。如果没有出峰，说明是样品处理出了问题。如果出峰，说明是液相出问题。
4、紫外没有出峰。检查样品处理过程，盐酸的量，浓度，PH和玻璃仪器的清洁度，以及溶出仪的有关参数。
5、如果紫外出峰了，可能的原因是样品在酸性条件下解离，结构异构化，导致出峰时间延迟。延长分析时间或使用梯度洗脱，看是否有样品出峰。
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2010/10/29 20:36:22 Last edit by 03yx2
阿三
junqiwudi
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2010/10/29 22:22:16 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 〓猪哥哥〓(03yx2) 发表:
庐山居士，你好

我觉得可能有几个原因：
1、色谱柱。因为最初使用的是盐酸为基质，对色谱柱可能有影响，更换一根色谱柱再试试。
2、定量环。对于这个问题，更换一个六通阀或者直接更换一台仪器试试。不过这个可能性会比较小，因为原实验出现了溶剂峰。
3、样品问题。把7个样品放入紫外下检测，看是否出峰。如果没有出峰，说明是样品处理出了问题。如果出峰，说明是液相出问题。
4、紫外没有出峰。检查样品处理过程，盐酸的量，浓度，PH和玻璃仪器的清洁度，以及溶出仪的有关参数。
5、如果紫外出峰了，可能的原因是样品在酸性条件下解离，结构异构化，导致出峰时间延迟。延长分析时间或使用梯度洗脱，看是否有样品出峰。
第5点中谈到解离，如果如此，出峰会提前，没有保留的，我觉得可能分析时间不够或如前面所说没有泵入流动相
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〓猪哥哥〓
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2010/10/30 8:59:49 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 阿三(junqiwudi) 发表:
原文由 〓猪哥哥〓(03yx2) 发表:
庐山居士，你好

我觉得可能有几个原因：
1、色谱柱。因为最初使用的是盐酸为基质，对色谱柱可能有影响，更换一根色谱柱再试试。
2、定量环。对于这个问题，更换一个六通阀或者直接更换一台仪器试试。不过这个可能性会比较小，因为原实验出现了溶剂峰。
3、样品问题。把7个样品放入紫外下检测，看是否出峰。如果没有出峰，说明是样品处理出了问题。如果出峰，说明是液相出问题。
4、紫外没有出峰。检查样品处理过程，盐酸的量，浓度，PH和玻璃仪器的清洁度，以及溶出仪的有关参数。
5、如果紫外出峰了，可能的原因是样品在酸性条件下解离，结构异构化，导致出峰时间延迟。延长分析时间或使用梯度洗脱，看是否有样品出峰。
第5点中谈到解离，如果如此，出峰会提前，没有保留的，我觉得可能分析时间不够或如前面所说没有泵入流动相


呵呵，我说的是因为在酸性条件下离子化后异构。不是单纯的解离
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