吸光光度法（紫外/可见光谱）讲座（10）
——提高吸光光度法灵敏度和选择性的某些途径1.2.5.1 示差吸光光度法示差吸光光度法是用一已知浓度的标准显色溶液与未知试样的显色溶液相比较，测量吸光度，从测得的吸光度求未知浓度。设标准溶液的浓度为c，试样溶液的浓度为cx，则A0=-－lg(I/I0)=abc
Ax=-－lg(Ix/I0)=abcx
lgI0－lgI＋lgIx－lg I0＝abc－abcx
lgIx－lg I＝ab（c－cx）
A差＝－lg（Ix / I）＝ab（c－cx） （1-36）以A差对（c－cx）作图，可以求出c－cx，c为已知，则cx可求得。按所选择测量条件不同，示差吸光光度法有三种操作方法：（l）高吸光度法。光电检测器未受光时，其透光度为零，光通过一个比试样溶液稍稀的参比溶液后照到光电检测器上，调其透光度（T）为100％，然后测定试样溶液的吸光度。此法适用于高含量测定。（2）低吸光度法。先用空白溶液调透光度为100％，然后用一个比试样溶液稍浓的参比溶液，调节透光度为零，再测定试样溶液的吸光度。此法适用于痕量物质的测定。（3）双参比法。选择两个组分相同而浓度不同的溶液作参比溶液（试样溶液浓度应介于两溶液浓度之间），调节仪器，使浓度较大的参比溶液的透光度为零，而浓度较小的参比溶液的透光度为100％，然后测定试样溶液的吸光度。示差吸光光度法可以提高光度法的精确性，从而实现用吸光光度法对物质中某一含量较高或较低的组分的测定。例如对高含量成分的测定，有时可达到与重量法、滴定法同等的精确度。其降低分析误差的主要依据就是对刻度标尺的放大作用。例如，假定用普通光度法测量参比溶液的透光度为10％，试样溶液的透光度为 7％，仅相差 3％。若用示差法，将参比溶液的透光度调到100％，则试样溶液的透光度为70％，两者之差增为30％，相当于放大读数标尺10倍。从而相对地增大了这种测量方法的精确性（图1-4）。在示差吸光光度法的测量中，要求一个实际具有较高吸收的参比溶液的表观刻度读数为A＝0或T＝100％，故所用的仪器必须具有出光狭缝可以调节，光度计灵敏度可以控制或光源强度可以改变等性能。
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图1-4 不同测量方法的示差吸光光度法的精确性
Figure 1-4 The accuracy of differential spectrophotometry with different measurement methods
2 双波长吸光光度法由于传统的单波长吸光光度测定法要求试液本身透明，不能有混浊，因而当试液在测定过程中慢慢产生混浊时就无法正确测定。单波长测定法对于吸收峰相互重叠的组分或背景很深的试样，也难于得到正确的结果。此外，试样池和参比池之间不匹配，试液与参比液组成不一致均会给传统的单波长吸光光度法带来较大的误差。如果采用双波长技术，就可以从分析波长的信号中减去来自参比波长的信号，从而消除上述影响，提高方法的灵敏度和选择性，简化分析手续，扩大吸光光度法的应用范围。双波长吸光光度法是将光源发射出来的光线，分别经过两个可以调节的单色器，得到两束具有不同波长(λ1、λ2)的单色光，利用斩光器使这两束光交替照射到同一吸收池，然后测量并记录它们之间吸光度的差值⊿A。若使交替照射的两束单色光λ1、λ2强度都等于I0，则－lg（I1 / I0）＝Aλ1＝ελ1bc＋As
－lg（I2 / I0）＝Aλ2＝ελ2bc＋As
As为光散射或背景吸收，若λ1和λ2相距不远时，As可视为相等，则－lg（I2 / I1）＝Aλ2－Aλ1＝⊿A
＝（ελ2－ελ1）bc 上式说明，试样溶液在波长λ1和λ2处吸收的差值，与溶液中待测物质的浓度呈正比关系。这就是应用双波长吸光光度法进行测定的依据。双波长测定法对混合组分分别定量时，一般是测定两个波长处的吸光度差，因此方法本身不能提高测定灵敏度。但是，用双波长法进行单组分测定时，如果选择显色剂的极大吸收波长和配合物的极大吸收波长作测定使用的波长对，由于形成配合物而降低之显色剂的吸收值直接加合在所形成的配合物的吸收上，使得配合物的表观摩尔吸光系数显著增加，这样使测定的灵敏度有所提高。3 导数吸光光度法在普通吸光光度法中，如果吸光度很小，就不能得到精度很好的信号。如果其他组分的吸收重叠在吸收峰上，测定就会受干扰。导数吸光光度法有可能克服这些困难。其原理是因为吸光度和摩尔吸光系数为波长的函数，所以朗伯-比尔定律可以用下式表示：Aλ＝ελcl将上式对波长进行一次微分，得若对波长进行n次微分，可得由此可知，吸光度对波长进行微分的微分值与吸收物质的浓度之间符合朗伯-比尔定律，因此它可以用于吸收物质的定量分析。获得微分光谱的方法可分为光学微分法和电学微分法两类，后者已在多种类型的微机控制分光光度计中得到了应用，它通常可以获得一、二、三、四阶导数光谱。导数光谱的测量有多种方法：（1）如果基线是平坦的，可以测量峰-谷之间的距离，这是最常用的方法。（2）在基线平坦的情况下，也可以测量峰-基线之间的距离，这时灵敏度虽有些降低，但精度较高。（3）作两峰的连接线，测量两峰连线到谷的距离。只要基线是直线，不管它是否倾斜，总能得到正确的值。（4）作峰顶与谷顶的切线，使其平行于基线，然后测量两平行线的距离。关于导数吸光光度法提高灵敏度的规律，有人指出n阶（n＝1～4）导数吸光光度法的灵敏度是按4.5n倍增大。4 三元配合物及其在光度法中的应用（1） 三元（多元）混配配合物由一种中心离子和两种（或三种）配位体形成的配合物称为三元混配配合物。例如Mo（Ⅵ）与NH2OH和硝基磺苯酚K形成的三元配合物。其结构式如图1-5所示。 ![]()
图1-5 Mo（Ⅵ）-NH2OH-硝基磺苯酚K三元配合物结构式
Figure 1-5 Structure pattern of Mo（Ⅵ）-NH2OH-nitrosulfaphenol K complex
混配配合物形成的条件首先是中心离子应能分别与这两种配位体单独发生配位反应，其次是中心离子与一种配位体形成的配合物必须是配位不饱和的，只有再与另一种配位体配位后，才能满足其配位数的要求。混配配合物ML1L2中，L1和L2可能都是有机配位体，亦可能其中之一是无机配位体。由于配位反应的空间效应，其中一种配位体最好是体积小的单齿配位体，如NH2OH，H2O2，F－等，另一种是多齿配位体。混配配合物的特点是极为稳定，并且具有不同于单一配位体配合物的性质，不仅能提供具有分析价值的特殊灵敏度和选择性，并且常常能改善其可萃性和溶解度。例如，用H2O2测定V（Ⅴ），灵敏度太低（ε450nm＝2.7×102 L·mol-1·cm-1），用 PAR显色灵敏度虽较高（ε550nm＝3.6×104 L·mol-1·cm-1），但选择性很差。如果在一定条件下使之形成 V（Ⅴ）-H2O2-PAR三元配合物，不仅灵敏度较高（ε540nm＝1.4×104 L·mol-1·cm-1），选择性亦较好。（2） 三元离子缔合物离子缔合物型三元配合物与三元混配配合物的区别是一种配位体已满足中心离子配位数的要求，但彼此间的电性并未中和，因此，形成的是带有电荷的二元配离子，当带有相反电荷的第二种配位体离子参与反应时，便可通过电价键结合成离子缔合物型的三元配合物。这类配合物体系多属M-B-R型。M为金属离子，B为有机碱，如吡啶、喹啉、安替比林类、邻二氮菲及其衍生物、二苯胍和有机染料等阳离子，R为电负性配位体，如卤素离子X－，SCN－，SO42－，ClO4－，Hg I2－，水杨酸，邻苯二酚等。离子缔合物型三元配合物在金属离子的萃取分离和萃取光度法中占有重要地位。由于在光度测定之前需要经萃取法分离、富集，因此，提高了测定的灵敏度和选择性。例如，在硫酸溶液中，InI4－配阴离子可与孔雀绿阳离子（B+）形成离子缔合物 B+［InI4］－，用苯萃取，测定吸光度，ε＝l.05×105 L·mol-1·cm-1，用于测定铟，非常灵敏。需要指出的是，为了克服离子缔合物用于光度分析需经萃取分离，操作比较麻烦和有机污染的缺点，采用水溶性高分子，如聚乙烯酸、阿拉伯树胶等增溶分散的方法，不仅可以直接在水相中进行测定，而且提高了测定灵敏度。例如，在 1.1 mol／L HCl介质中，在聚乙烯醇存在下，Zn2+-SCN－-罗丹明体系的ε607nm＝2.6×106 L·mol-1·cm-1。（3） 三元胶束配合物和增溶吸光光度法当在金属离子和显色剂的配位体系中加入被称为表面活性剂的物质时，由于表面活性剂的增溶、增敏、增稳和褪色等作用，不仅能使某些原本难溶于水的显色体系可以在水溶液中测定，而且能大大提高分析的灵敏度，有时还能提高测定的选择性和改善测量条件。这类方法称为胶束增溶吸光光度法。表面活性剂是一类既含有能与水相溶的亲水基，同时又含有能与油相溶的亲油基（疏水基）的物质。按其电离后活性部分是阳离子或阴离子而分为阳离子型、阴离子型和两性型表面活性剂。还有一类极难电离的表面活性剂称为非离子型表面活性剂。表1-4列出了常用的数种表面活性剂。表1-4 吸光光度法常用的几种表面活性剂
Table 1-4 Common surfactants used in spectrophotometry
类 别 符 号 中 文 名 称 |
阳离子型 CTMAB 溴化十六烷基三甲基铵
Zeph 氯化十四烷基三甲基苄基铵
阴离子型 SDS 十二烷基硫酸钠
SLS 十二烷基磺酸钠
两性型 DDAPS 3-（二甲基十二烷基铵）丙基-1-磺酸钠
非离子型 TritonX-100 p-1,1,3,3-四甲基丁基酚聚氧乙烯（9-10）醚 |
在低浓度时，表面活性剂在水中以离子或分子状态存在，但浓度超过一定值后（此值称该表面活性剂的临界胶束浓度），由于分子中烃链的疏水性而相互聚集形成胶束。由于吸光光度法中加入的表面活性剂量都在cmc值之后，所以称为胶束增溶吸光光度法。5 萃取光度、浮选光度和固相光度法这三类方法都是将待测组分先分离、富集到另一相后再进行光度测定，从而提高测定灵敏度和选择性。（1） 萃取光度法把待测组分从一种液相（水相）转移到另一种液相（有机相），以达到分离和富集目的的过程称为萃取。萃取是基于溶质在两种基本不相混溶的溶剂之间的分配差异来实现分离的。只要溶质在有机溶剂中的溶解度大于在水中的溶解度就可能实现萃取。由于带电荷的化合物不能进入有机溶剂，金属离子必须转变为不带电荷的配合物，或与带相反电荷的离子形成离子（对）缔合物后才能被萃取入有机相。萃取光度法就是溶剂萃取与光度测定相结合的一种分析方法。它将水相中的有色物质直接萃取到少量与水不互溶的溶剂中后进行吸光度测定，它特别适用于显色产物难溶于水的体系。由于萃取的分离和富集作用，能有效地提高测定的灵敏度和选择性。例如，用乙醚萃取Mo（Ⅴ）与 SCN－形成的配合物后进行光度测定，比直接在水相中测定灵敏度提高九倍；利用Pd（Ⅱ）与DDO（双十二烷基二硫代乙酸胺）二元配合物的萃取光度法测定钯，其ε高达3.6×106 L·mol-1·cm-1，是一种超高灵敏度的测定方法。（2） 浮选光度法浮选光度法可分为溶剂浮选和泡沫浮选两类。前者靠有机溶剂将水相试液中的待测物带到两相界面上，经分离和除去溶剂后，再把待测物溶于少量的另一种溶剂中进行光度测定。例如，在［H+］＝0.45 mol / L介质中，用环己烷作浮选剂浮选 Hg（Ⅱ）-I－-亚甲基蓝配合物使之与水相分离，蒸发除去环己烷，残余物溶于少量甲醇中后进行光度测定，ε670nm＝1.5×105 L·mol-1·cm-1。泡沫浮选法则使用适当的起泡剂（如表面活性剂），使待测组分以离子形式或配合物形式随泡沫一起与原试样溶液分离，随后加入合适的消泡剂消泡后进行光度测定。例如在pH7的条件下，以CTMAB作起泡剂浮选CN－-氯胺T-异烟酸吡唑啉酮配合物，然后用乙醇作消泡剂，可用于CN－的测定，ε638nm＝5×104 L·mol-1·cm-1。（3） 固相光度法
这是利用固相载体（离子交换树脂、泡沫塑料或滤纸）对待测组分进行分离、富集并显色，随后直接测定固相吸光度的方法。例如，已有强碱性阴离子交换树脂作载体，用于BiI4－，Bi（Ⅲ）-4邻苯三酚红，Hg（Ⅱ）-双碱腙和磷（砷）杂多蓝等显色体系；强酸性阳离子交换树脂作载体用于Nb（Ⅴ）-5-Br-PADAP-酒石酸显色体系；泡沫塑料作载体用于Au（Ⅲ）-硫代米黄酮，Zn（Ⅱ）-双硫腙等显色体系的报导。6 长光路毛细吸收管吸光光度法根据朗伯-比耳定律，A＝εbc，当浓度不变而增大b时，A增大。换言之，可以通过延长吸收光程b来降低待测吸光物质的浓度c，从而提高光度法的测定灵敏度。近年来，提出了 全反射型长光路毛细吸收管吸光光度法。该法使用长至数十米的毛细管吸收池（Long Capillary Cell，简称 LCC），可以高灵敏度地测定溶液极其微弱的吸收。已有的报导表明，它已能顺利地测定水中pg／g级的磷和ng／g级的氟，使光度法测定铜、汞的灵敏度提高了三个数量级。用50m长的毛细管液芯光纤系统，可使Hg，I，Cu，P等元素的测定灵敏度达0.02pg／g。从LCC的管型而言，已从最初较短的“直线型”、“弧型”和“圈型”，发展到较长的“螺旋型”和“光导纤维型”（图1-6）。例如，用内径为lmm，长10m的螺旋型耐热玻璃管作吸收池，或者用内径为250μm，长25m或50m的硅树脂涂覆的毛细纤维管作吸收池，后者称为“光导纤维型”吸收管。因此又称为液芯光纤长光路吸光光度法。 ![middle]()
图6 长光路毛细吸收管
Figure 6 Long light path capillary absorption tube
从光在LCC中的传输方式而言，已有的研究认为，大致可设想为图1-7所示的两种形式：镜面反射和全反射。当光的传输介质满足全反射条件时，光主要以螺旋光线的形式通过LCC；当反射率不是100％，则光按镜面反射方式传输，此时入射光主要以较少的反射次数在同一平面内，按子午光线的形式通过LCC管。 ![middle]()
图7 长光路毛细吸收管中的反射光路
Figure 7 Reflection light path in long light path capillary absorption tube
按Snell的折射定律
Sin（90°－θ）≥ n2 / n1 （1-39）
式中θ为入射角，n1为溶剂折射率，n2为 LCC材料的折射率。只有n1＞n2，即只有使用折射率大于 LCC材料折射率的液体做溶剂，才能在LCC中实现全反射。例如，常用作 LCC材料的石英玻璃和耐热（Pyrex）玻璃，在20℃时对589.3nm光的折射率分别为1.459和1.474。相同条件下，水的折射率为1.333，苯和二硫化碳的折射率分别为1.501和1.627。显色反应以水为溶剂时，入射光在LCC中主要以镜面反射方式传输。为了满足全反射的条件，必须把显色物质转入（如萃取）到高折射率的溶剂中。用于全反射的溶剂可以是单一溶剂，亦可以是混合溶剂（称为混折射溶剂）。已有的研究表明，即使在镜面反射（如水作溶剂）的LCC中，灵敏度（吸光度）增加的倍率亦明显大于吸收管增长的倍率。例如，磷钼蓝法测磷，用1m的LCC比用通常1cm吸收皿灵敏度增加约300倍而不是100倍。这主要是由于吸收管壁的反射，增加了有效的吸收光程长度。在全反射条件下，由于高折射率的溶剂使入射光多重反射，进一步增大了有效的吸收光程长度，从而吸光度增加的倍率又明显高于镜面反射时的倍离，大约增至700倍。由于随溶液浓度的增加，吸收增加，反射率下降，LCC内反射光的光路长减小。因此，吸光度增加的倍率随溶液浓度的增大而减少，从而使LCC的工作曲线曲率加大，偏离朗伯-比尔定律。所以，长光路毛细吸收管吸光光度法与普通吸光光度法不同，其工作曲线不是直线。综上所述，全反射长光路毛细吸收管法可以高灵敏度地测定溶液中极其微弱的吸收，大大提高了光度法的灵敏度。虽然目前它的研究和应用还不够深入和广泛，其理论研究尚不成熟，但毋容置疑它是一种有发展前途的超微量分析法。
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