1、吸附剂的选择

进行色谱分离时，应选择合适的吸附剂（固定相），常用的吸附剂有：硅胶G、氧化镁、氧化铝、活性碳等。一般要求吸附剂：①有大的表面积和一定的吸附能力；②颗粒均匀，不与被分离物质发生化学作用；③对被分离的物质中各组份吸附能力不同。目前常用的吸附剂吸附极性化合物能力的顺序为：纸<纤维素<淀粉<糖类<硅酸镁<硫酸钙<硅酸<硅胶<氧化镁<氧化铝<活性碳。

氧化铝吸附剂有碱性、酸性、中性三种。碱性氧化铝（pH9~10）用于碳氢化合物、对碱稳定的中性色素、甾类化合物、生物碱的分离；中性氧化铝（pH7.5）应用最广，用于分离生物碱、挥发油、萜类化合物、甾体化合物及在酸、碱中不稳定的苷类、酯、内酯等；酸性氧化铝（pH4~5）用于氨基酸及对酸稳定的中性物质。

氧化铝的活性分为Ⅰ~Ⅴ级，Ⅰ级吸附能力太强，Ⅴ级吸附能力太弱，很少应用，一般用Ⅱ~Ⅲ级。

硅胶也是常用的吸附剂，系多孔性的硅氧环（—Si—O—Si—）交链结构，骨架表面有很多

—Si—OH，—OH能吸附极性分子。常用于有机酸、氨基酸、萜类、甾体类化合物的分离。

吸附剂的吸附能力（活性）与其含水量有关，含水量越大，吸附剂的活性越小。故常用加热“活化”——降低含水量，加大活性。如氧化铝放在高温炉（350℃~400℃）烘烤3小时，得无水氧化铝，然后加入不同量的水分，即得不同活性的氧化铝；硅胶在105℃~110℃烘箱中恒温0.5~1小时，可达到活化目的。

2、洗脱剂（流动相）的选择

吸附剂选择原则是根据被分离物质各组分的极性大小、在洗脱剂中溶解度大小进行选择。即洗脱剂对被分离各种组份溶解能力不同，容易溶于洗脱剂中不太易吸附于吸附剂的组份，优先随洗脱剂被洗出来；不易溶于洗脱剂而易被吸附剂吸附的组份，被洗脱的速度慢，从而达到分离物质的目的。各组份在洗脱剂中溶解能力，基本上是“相似相溶”，即欲洗脱极性大的组份，选择极性大的洗脱剂（如水、乙醇、氨等）；极性小的组份宜选用极性小的洗脱剂（如石油醚、乙醚等）。常用洗脱按极性大小顺序可排列如下：

石油醚（低沸点<高沸点）<环己烷<四氯化碳<三氯甲烷<乙醚<甲乙酮<二氧六环<乙酸乙酯<正丁醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸。

另外，被分离物质与洗脱剂不发生化学反应，洗脱剂要求纯度合格，沸点不能太高（一般为40℃~80℃之间）。

实际上单纯一种洗脱剂有时不能很好分离各组份，故常用几种吸附剂按不同比例混合，配成最合适的洗脱剂。

3、操作方法

柱色谱操作方法分为：装柱、加样、洗脱、收集、鉴定五个步骤。

（1）装柱

可用干法装柱和湿法装柱两种装柱方法。

干法装柱：将干燥吸附剂，经漏斗均匀地成一细流慢慢装入柱中，时时轻敲打玻璃管，使柱填得均匀，有适当的紧密度，然后加入溶剂，使吸附剂全部润湿。此法简便，缺点是易产生气泡。

湿法装柱：将洗脱剂与一定量的吸附剂调成糊状，慢慢倒入柱中，将柱下的活塞打开，使溶剂慢慢流出，吸附剂渐渐沉于柱底。

吸附剂用量，一般为被分离物质的量的30~50倍。如果被分离组分性质相接近，吸附剂用量要更大些，甚至达到至100倍。柱高与柱直径比约为7.5／1。

（2）加样

样品为液体，可直接加样；样品为固体，可选择合适溶剂溶解为液体再加样。加样时，要沿管壁慢慢加入至柱顶部，勿使样品搅动吸附剂表面。放开下部活塞，样品会慢慢进入吸附中，待样品刚全部进入吸附剂中，关闭活塞，加入流动相（洗脱剂）。此时样品集中在柱顶端一小范围的区带。

（3）洗脱

在柱顶用一滴液漏斗，不断加入洗脱剂，使洗脱剂永远保持有适当的量，不要让洗脱剂表面流干。调节下面开关大小，使流动相流速适当。流速过快，组分在柱中吸附—溶解来不极达成平衡，影响分离效果；流速太慢则会延长整个操作时间。

（4）收集样品各组份

各组分如果均有颜色，则在柱上分离情况可直接观察出来；直接收集各种不同颜色的组分；多数情况是各组无颜色。一般采用多份收集，每份收集量要小。然后对每份收集液进行定性检查，根据检查结果，合并组分相同的收集液，蒸去洗脱剂，留待作进一步的结构分析

（5）鉴定

对各种组份进行结构分析。

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