主题：【资料】高效液相色谱串联质谱测定猪肉中新型兽药泰拉霉素

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发表于：2010/11/27 18:12:42 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

高效液相色谱串联质谱测定猪肉中新型兽药泰拉霉素

摘要建立了猪肉中新型兽药泰拉霉素的液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）联用确证方法。样品用甲醇+0.1%磷酸（70:30 v/v）提取，离心后用PCX固相萃取小柱净化，Symmetry®C8色谱柱分离，串联质谱多反应监测(MRM)模式下分析，内标法定量。方法的线性范围为10~500μg/kg，检出限为5.0μg/kg，在10、20和50μg/kg 3个浓度水平进行添加实验，平均回收率为93.1%~105.5%，批内相对标准偏差为1.5%~4.6%，批间相对标准偏差为1.8 %~5.6%。

关键词高效液相色谱串联质谱，猪肉，泰拉霉素，残留

泰拉霉素（Tulathromycin）是一种新近上市且为动物专用的大环内酯类半合成抗生素，分子式为C₄₁H₇₉N₃O₁₂(分子量806)。我国农业部在2008年第957号公告中首次允许泰拉霉素在动物生产中使用。泰拉霉素主要用于放线杆菌、支原体、巴氏杆菌、副嗜血杆菌引起的猪、牛的呼吸系统疾病。具有用量少、一次给药、低残留和动物专用等众多优点^[1-2]。在我国，大环内酯类药物现行使用较为广泛的是泰乐菌素和替米考星，虽然这2种药物在生产中都取得了良好的效果，但随着使用时间的延长，我国很多地区出现了不同程度的耐药性，导致用量不断增大，但治疗效果却在逐步降低^[3]，而泰拉霉素药效均强于泰乐菌素和替米考星等市场广泛使用的大环内酯类药物。因此，泰拉霉素在畜禽生产中使用前景非常广阔，其残留分析方法研究也显得尤为必要。

目前国内外大环内酯类药物残留检测方法已有ELISA筛选法、薄层色谱法、气质联用法、高效液相色谱和高效液相色谱串联质谱法等众多方法^[4-12]。但泰拉霉素的残留检测方面研究较少^[2]，国内尚未见有相关报道。本研究建立了以罗红霉素(C₄₁H₇₆N₂O₁₅, 837)为内标的泰拉霉素HPLC-MS/MS方法，方法的定量限为10μg/kg，可以满足国内外有关法规对其残留检测的要求，可为残留监控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1仪器与材料

Waters 2695 Quattro Micro^TM API高效液相色谱串联质谱仪（美国Waters公司）；固相萃取仪（美国SUPELCO公司）。

泰拉霉素标准品(Sigma公司)；罗红霉素 (Sigma公司)；乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；其余试剂均为分析纯试剂。PCX固相萃取柱(3 mL, 60 mg，AGELA公司)。

1.2标准溶液的配制

泰拉霉素和内标储备液：分别准确称取10mg标准品于10mL容量瓶中，用0.05M K₂HPO₄/乙腈（75:25，v/v; pH6）定容，混匀后置冰箱冷藏储存，有效期3个月。

标准工作溶液的配制：吸取储备液1mL于100mL容量瓶中并用0.05M K₂HPO4/乙腈（75:25，v/v; pH6）定容，再从中吸取1mL于50mL容量瓶中得0.2mg/L，用于添加（置冰箱冷藏储存，有效期2个月）。内标物罗红霉素的添加溶液配制方法同泰拉霉素。

1.3样品制备

称取2.0g组织样品于50mL的聚四氟乙烯塑料管中，加入10mL甲醇+0.1%磷酸提取液（70:30 v/v）和50μL内标工作液，匀质1 min后5000rpm转速离心2min，收集上清液过已经分别用3mL甲醇和3mL提取液润洗过的60mg/3mL的PCX小柱，待全部过柱后，再用3mL水、3mL甲醇淋洗，最后用4mL4%的氨化甲醇洗脱，50℃水浴氮气吹干后用1mL流动相定容，进行HPLC-MS/MS分析。

1.4仪器分析条件

液相色谱条件：Symmetry®C₈ 5μm 3.9mmx20mm，流动相：乙腈：0.1%甲酸水溶液=70:30；柱温：30℃，进样室温度15℃，进样量：10μL，流速为0.3mL/min。质谱条件：电离模式：ESI（+）；检测方式：多级反应检测（MRM）；毛细管电压：4.2 KV；锥孔电压：20 V；RF透镜电压：0.2 V；离子源温度：110 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；锥孔气流速：100 L/h；脱溶剂气流速：600 L/h；二级碰撞气：氩气。

1.5添加回收率实验

添加回收率实验添加浓度为10、20和50µg/kg，实验步骤同1.3。

2 结果与讨论

2.1样品的提取和净化

泰拉霉素含3个氨基基团，为弱碱性化合物，易溶于酸性溶液和极性溶剂中，在pH 6~8的水溶液中较稳定，在pH < 4和pH > 9条件下均不稳定。对泰拉霉素残留的提取和净化方法的设计主要依据其弱碱性、脂溶性和酸碱不稳定性。本实验比较了4种提取液：乙腈-0.1%偏磷酸（70:30 v/v）、甲醇-0.1%偏磷酸（70:30 v/v）、乙腈-0.1%磷酸（70:30 v/v）、甲醇-0.1%磷酸（70:30 v/v）对泰拉霉素的提取效果。结果表明，甲醇-0.1%磷酸（70:30）提取液对泰拉霉素的提取效果较好，回收率高于其他提取液，故本方法选择甲醇-0.1%磷酸（70:30）为样品提取液。

液-液分配（LLE）和固相萃取（SPE）是大环内酯类药物的2种主要净化手段，其中LLE操作较麻烦且回收率较低、重复性较差，所以本研究采用固相萃取技术净化，并比较了3种SPE净化小柱：SUPELCO C₁₈小柱、Oasis MCX小柱和PCX小柱, 由于Oasis MCX小柱和PCX小柱兼有阳离子交换和疏水作用机制，基于泰拉霉素的弱碱性和脂溶性的理化特性，Oasis MCX小柱和PCX小柱的净化效果好于C₁₈小柱。Oasis MCX小柱和PCX小柱提取效率没有明显差别，但PCX小柱成本低，所以，本方法净化选择PCX小柱。

2.2色谱质谱条件的优化

对于泰拉霉素残留分析，色谱柱的选择是关键，当用长柱子分析时峰形较差，并易形成拖尾，于是本实验选择保护柱Symmetry®C₈(5μm, 3.9mm ×20mm)作为分析柱，结果发现泰拉霉素峰形较好。

根据泰拉霉素的分子结构的特征，我们选择了ESI(+)作为电离模式。通过流动注射直接进样优化相关参数，质谱图见图1，母离子、子离子以及定性、定量离子对见表1所示。

参考文献：
[1] 李玮，郭腾，陈洪亮，等.兽用新型大环内酯类抗生素-土拉霉素(tulathromycin) [J]. 中国动物保健，2006, 4:38-39.
[2] Scheuch E, Spieker J, Venner M, et al. Quantitative determination of the macrolide antibiotic tulathromycin in plasma and broncho-alveolar cells of foals using tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2007(850): 464-470.

[3] 李俊锁，李俊锁，邱月明，等.兽药残留分析.上海:上海科学技术出版社，2002:413-417.

[4] 岳振峰，陈小霞，谢丽琪，等. 高效液相色谱串联质谱法测定动物组织中林可酰胺类和大环内酯类抗生素残留[J]. 分析化学，2007, 35 (9) : 1290-1294.

[5] Berrada H, Borrull F, Font G, et al. Validation of a confirmatory method for the determination of macrolides in liver and kidney animal tissues in accordance with the European Union regulation 2002/657/EC[J].Journal of Chromatography A, 2007(1157):281-288.

[6] Masakazu H, Harumi T, Kazuo T. Determination of macrolide antibiotics in meat and fish by liquid chromatography electrospray mass spectrometry[J].Anal Chim Acta, 2003(492):187-197.

[7] Godinho KS, Rae A, Nanjiani IA et al. Efficacy of tulathromycin in the treatment of bovine respiratory disease associated with induced Mycoplasma bovis infections in young dairy calves[J].Vet Ther, 2005, 6(2): 96-112.

[8] Norcia L J, Silvia A M, Santoro S L, et al. In vitro microbiological characterization of a novel azalide, two triamilides and an azalide ketal against bovine and porcine respiratory pathogens[J]. J Antibiot, 2004(57): 280-288.

[9] Hart F J, Kilgore R W, Nutsch R G, et al. Efficacy of tulathromycin in the treatment of respiratory disease in pigs caused by Actinobacillus pleuropneumoniae[J].Vet Rec,2006(158): 433-436.

[10] Nutsch R G, Hart F J, Rooney K A, et al. Efficacy of tulathromycin injectable solution for the treatment of naturally occurring swine respiratory disease. Vet Ther,2005(6): 214-224.

[11] Nanjiani I A, McKelvie J, Benchaoui H A,et al. Evaluation of the therapeutic activity of tulathromycin against swine respiratory disease on farms in Europe. Vet Ther, 2005(6): 203-213.

[12] Galer D, Hessong D S, Beato B,et al. An analytical method for the analysis of tulathromycin, an equilibrating triamilide, in bovine and porcine plasma and lung.J Agric Food Chem, 2004(52):2179-2191.

附件：

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