主题：邻甲苯胺及其异构体的气质及液相色谱分离

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风肃

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发表于：2010/11/27 17:16:42 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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看见同行（看着这话题，绝对是同行，多交流）发着文章http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20101012/2857370/，我这把手上的东西整整，算是补充吧。大家多多提意见吧！

摘要针对纺织品偶氮染料检验中常检出的禁用邻甲苯胺及其异构体，结合气相色谱-质谱和高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC/DAD），摸索了以气相色谱-质谱进行初期定性筛选、以高效液相色谱进行确证和定量的芳香胺异构体检测方法，避免了检验中其异构体造成的假阳性检出。本方法在2 μg/mL～100 μg/mL浓度范围内线性关系良好，线性相关系数可达到0.9999；回收率为51%～62%。

关键词 纺织品；检测；禁用邻甲苯胺；异构体

1 前言

采用气相色谱-质谱联用方法检测染料产品中24种有害芳香胺含量，按照现行国家标准^[1]中提供的气相色谱条件，会有多种异构体保留时间相同或非常接近，而且这些异构体的质谱图又非常相似，从而造成无法使用特征离子对其进行定性和定量，往往会形成假阳性结果的产生。当前针对有害芳香胺的气相色谱/质谱检测方法，大都采用非极性或极性较弱的色谱柱^[1^-^4]，如HP-5MS、DB-5MS、DB-35MS，这些色谱柱普遍存在的缺点是对常见的异构体不能很好的分离。有文献^[5]报道采用中等极性色谱柱DB - 17MS(固定相等同于50%苯甲基聚硅氧烷),对芳香胺异构体有一定的分离能力，但没能实现禁用芳香胺的基线分离，造成定量上的偏差。高效液相色谱法（HPLC）可同时测定多种芳香胺，在分离异构体上是强有力的确证方法，准确定性和定量，分析方法易于推广。本方法采用气相色谱-质谱联用对异构体进行初期定性筛选、以高效液相色谱进行确证并外标定量，对常检出的的禁用邻甲苯胺及其异构体检测进行了研究。本方法通过进一步摸索优化高效液相色谱条件，使邻甲苯胺及其异构体达到基线分离，有效避免了检测过程中的假阳性检出。

2 实验材料与方法

2.1 仪器和设备

气相色谱/质谱联用仪：美国Agilent 公司7890A /5975 C，带自动进样器，四极杆质谱检测器；

气相色谱柱：HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox，325 °C：30 m x 250 μm×0.25 μm；

液相色谱仪：Agilent 1200，带自动进样器和柱温箱；

液相色谱柱：ODS-C18；

真空旋转蒸发器；反应器；恒温水浴；提取柱。

2.2 液相色谱操作条件

流动相：甲醇：水（V%：V%）= 30：70；

流量：1.0 mL/min；

进样量：10 μL；

柱温：28 ℃；

检测波长： 240 nm。

2.3 试剂

柠檬酸盐缓冲溶液：0. 06mol/L 水溶液，pH = 6.0；

连二亚硫酸钠溶液：200g/L 水溶液；

乙醚：经硫酸亚铁处理，不含过氧化物；

甲醇，色谱纯；

邻甲苯胺：分析纯；

间甲苯胺：分析纯；

对甲苯胺：分析纯；

2.4 方法验证

参照欧盟标准BS EN 14362-1: 2003^[6]，将1.0mL芳香胺标准溶液和1.0mL甲醇加入至含15mL预热的柠檬酸盐缓冲液的反应器中，然后进行芳香胺的分离和浓缩。BS EN 14362-1: 2003规定邻甲苯胺的回收率需达到50%^[6]。

3 结果与讨论

3.1 气相色谱质谱分离

首先在现有气相色谱条件下，通过细化柱升温程序（见表1），对标准样品进行气相色谱分离。

首先对邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺的单标进行测定，其总离子流图、样品质谱和标准质谱图分别见图1、图2和图3。对谱图分析，发现：（1）三者的特征离子种类及丰度比相似度极高；（2）邻、间、对甲苯胺的保留时间分别为：6.837分钟、6.916分钟、6. 836分钟，邻甲苯胺能与对甲苯胺很好的分离，但是邻甲苯胺和对甲苯胺的保留时间却重合。后进行邻（间、对）甲苯胺的混标液进样分析，实验结果（见图4）进一步确定了从保留时间上无法区分邻甲苯胺和对甲苯胺，从特征离子上难以区分邻（间、对）甲苯胺。

为了将邻、对甲苯胺分离，尝试升温程序细化，邻、对甲苯胺混标进样分析，发现改变柱升温程序后依然不能实现邻甲苯胺、对甲苯胺的分离（见图5）。因此，在测定含有禁用邻甲苯胺的纺织样品时，现有的气质条件无法避免邻甲苯胺假阳性检出，需要更有力的定性、定量手段来确保报出结果的准确性。

3.2 高效液相色谱分离

3.2.1 色谱柱的选择

分别试验了ODS-C18柱、硅胶柱、氰基柱等多种色谱柱进行分离试验，结果表明ODS-C18柱效果最好，样品各组份分离完全，在恒梯度时在15分钟内即可实现很好的分离（见图6-C）。

3.2.2 流动相

以甲醇和水为流动相，试验了甲醇浓度对邻、间、对甲苯胺的保留时间（见图6）和容量因子（K’）的影响（见图7）。当甲醇占流动相比例为30%时，即可在较短的25分钟内实现邻、间、对甲苯胺的完全基线分离，当甲醇占比例为40%时，即可在15分钟内实现邻、间、对甲苯胺的准基线分离。

采用乙腈-水、乙腈-缓冲盐、甲醇-缓冲盐作为流动相，分离效果也非常好，但是考虑到乙腈价格昂贵、毒性大，缓冲盐在使用过程中对仪器维护要求更高、维护时间延长而变相增加样品测试时间，故采用甲醇-水为流动相。

3.3 线性范围

配制2 μg/mL， 5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，40 μg/mL，60 μg/mL，100 μg/mL六个浓度的邻甲苯胺标准工作溶液，按优化的高效液相色谱条件进行外标法定量标准工作曲线的制定，在240 nm波长下，用积分法测定定量离子的响应值(峰面积)，以峰面积为纵坐标，待测物的质量浓度为横坐标进行线性回归，建立邻甲苯胺标样质量浓度和峰面积之间的校正曲线，可在确定的线性范围内进行准确定量。得到曲线方程为：Area = 28.08*Amt-5.90，相关系数为0.99998，线性关系良好。

3.4 回收率和精密度试验

按照欧盟标准BS EN 14362-1: 2003^[6]，分别添加20 mg/kg，60 mg/kg，100 mg/ kg考察方法的回收率。每个样品重复测定6 次，考察方法的精密度，结果见表2，符合欧盟标准BS EN 14362-1: 2003的分析系统验证要求。

3.5 检测低限

根据3.4和3.4，待测物浓度为2 μg/mL时，信噪比添加水平为41，故仪器检测限可满足国家标准以及欧盟标准的要求；回收率实验添加水平为20 mg/kg时，对氯苯胺回收率大于50％，而且方法学数据是可靠的，表明方法的定量限可以达到20 mg/kg，满足国家强制性标准GB 18401-2003^[7]中禁用可分解芳香胺染料“检出限为20 mg/kg”以及欧盟标准BS EN 14362-1: 2003附录D^[6]中评判指导中芳香胺检出界限值为30 mg/kg 的要求。

4 本方法的优越性及可行性

禁用芳香胺的检测主要采用GC-MS，而由于GC-MS对异构体分离能力的欠缺，在检测含异构体的芳香胺时，常造成假阳性结果；随着国家强制性标准GB 18401-2003执行，禁用芳香胺的检出率逐年下降，故可以采用GC-MS进行初步定性筛选和进行无异构体芳香胺的定性定量，如果定性检测发现带异构体芳香胺时，则进行HPLC确证和定量。本文针对邻甲苯胺，摸索了HPLC检测条件的优化，采用ODS-C18柱，以甲醇-水为流动相，可在短时间内实现异构体的基线分离，而且在2 μg/mL～100 μg/mL间线性关系良好；通过回收率以及精密度实验，满足各项禁用偶氮染料测试标准要求，避免了邻甲苯胺的假阳性检出。

5 结论

结合GC-MS，该试验建立了快速确证纺织品中禁用邻甲苯胺异构体的HPLC测定方法。该方法简便、快速、准确，方法的定量限可达到20 mg/kg，可用于纺织品中禁用邻甲苯胺异构体的确证检验。

参考文献

[1] GB/T 17592-2006,《纺织品禁用偶氮染料的测定》.

[2] 杨继生,徐逸云,蒋华. 对纺织品禁用偶氮染料检测方法的探讨 [J]印染. 2005, 06: 37-39.

[3] 康宁. 禁用偶氮染料检测中的若干问题[J]. 中国纤维. 2005. 8: 24-25.

[4] 胡小钟,余建新等. 禁用偶氮染料检测中假阳性结果的鉴别方法 [J]. 分析化学研究报告. 2000, 4(28): 411-416.

[5] 季浩. 染料产品中几种常见有害芳香胺异构体的鉴别 [J]. 染料与染色. 2007, 44(6): 54-56.

[6] BS EN 14362-1:2003, Textiles – Methods for the determination of certain aromatic amines derived from azo colorants – Part 1: Detection of the use of certain azo colorants accessible without extraction .

[7] GB 18401-2003,《国家纺织产品基本安全技术规范》.