主题：【分享】水产品中的孔雀石绿固相萃取净化方法

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发表于：2010/12/06 09:43:58 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

美国瓦里安公司

1. 鲜活水产品

1.1 样品前处理

称取5.00g已捣碎样品于50mL离心管中，加入200μL混合内标标准溶液（氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀

石绿各100ng/mL），加入11mL乙腈，超声波振荡提取2min，8000r/min 匀浆提取30s，4000 r/min离心5min，上清液转移至25mL比色管中；另取一50 mL离心管加入11mL乙腈，洗涤匀浆刀头10s，洗涤液移入前一离心管中，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，漩涡混匀器上振荡30s，超声波振荡5min，4 000r/min离心5min，上清液合并至25mL比色管中，用乙腈定容至25.0mL，摇匀备用。

1.2 SPE净化

移取5.00mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱（Bond Elut AL-N, 1g/6mL,PN.12256086）上，用KD

浓缩瓶接收流出液，4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱，收集全部流出液，45℃旋转蒸发至约1mL，残液用乙腈定容至1.00mL，超声振荡5min, 加入1.0mL 5mmol/L 乙酸铵，超声振荡1min，样液经0.2μm滤膜过滤后供液

相色谱-串联质谱测定。

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2010/12/6 9:44:05 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

2.加工水产品

2.1样品前处理

称取5.00g已捣碎样品于100mL离心管中，加入200μL混合内标标准溶液（氘代孔雀石绿和氘代隐色孔

雀石绿各100ng/mL），依次加入1mL盐酸羟胺(0.25g/mL)、2mL 对-甲苯磺酸（1.0mol/L ）、2mL 乙酸铵缓冲溶液（0.1mol/L）和40mL乙腈，匀浆2min(10000r/min)，离心3min(3000r/min)，将上清液转移到250mL分液漏斗中，用20mL乙腈重复提取残渣一次，合并上清液。于分液漏斗中加入30ｍＬ二氯甲烷、35mL水，振摇2min，静置分层，收集下层有机层于150mL梨形瓶中，再用20mL二氯甲烷萃取一次，合并二氯甲烷层，

45℃旋转蒸发近干。

2.2 SPE净化

将中性氧化铝柱（Bond Elut AL-N 1g/6mL,PN.12256086）串接在阳离子交换柱（Bond Elut Plexa

PCX,60mg/3mL，PN.12108303）上方。用6mL乙腈分三次（每次2mL），用旋涡震器涡旋溶解上述提取物，并依次过柱，控制阳离子交换柱流速不超过0.6mL/min，再用2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后，弃去中性氧化铝柱。依次用3mL 2%（v/v）甲酸溶液、3mL乙腈淋洗阳离子交换柱，弃去流出液。用4mL 5%（v/v）乙酸铵甲醇溶液 (5%，v/v)洗脱，洗脱流速为1mL/min，用10mL刻度试管收集洗脱液，用水定容至10.0mL，样液经0.2μm滤膜，过滤后供液相色谱-串联质谱测定。

3. HPLC-MS/MS检测

液相色谱-串联质谱条件

a) 色谱柱：Pursuit C18柱，50mm×2.1mm×3μm；SPE Application Note Varian SPE Technology - 2 -

b) 流动相：乙腈：5mmol/L 乙酸铵（75：25，v/v）；

c) 流速：0.2mL/min；

d) 柱温：35℃；

e) 进样量：10μL；

f) 离子源： ESI，正离子；

g) 扫描方式：多反应监测MRM；

4. 样品组分

孔雀石绿、氘代孔雀石绿、结晶紫、氘代隐色孔雀石绿、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫

本方法中使用的SPE 柱：

Bond Elut PCX（60mg/3mL，PN.12108303）

Bond Elut AL-N（1g/6ml, PN. 12256086）

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