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主题：【第三届原创大赛】举例讲解——色谱缓冲体系pH的选定

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发表于：2010/12/19 16:59:13 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

维权声明：本文为gl19860312原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。

原创：举例讲解色谱缓冲体系pH的选定

写在前面——反相色谱法：

一般用非极性固定相（如C₁₈、C₈）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。反相色谱在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

选择缓冲液正确的pH值，缓冲体系pH值的选择在反相高效液相色谱分析中，对可离解的化合物分析的重现性十分重要，不恰当的pH值可能导致出现不对称峰、宽峰、分裂峰或肩峰，而尖锐的、对称的峰是定量、定性分析中获得低的检测限，是两次甚至多次分析之间较低的相对标准偏差(RSD)和保留时间的高重现性的前提。我们将讨论在使用缓冲液时如何选择缓冲液的pH值，以及如何选择正确的缓冲体系。
　　

什么时候需要缓冲溶液?
　　随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但值得注意的是，C₁₈和C₈使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。在反相条件下可离解的化合物一般都有氨基和羧基，他们的Pka在1-11之间，选择正确的缓冲液PH值可保证可离解的官能团以一种形式存在，离子形式或中性化合物的形式。如果样品的PH值对柱子有伤害，则缓冲溶液可使其变温和从而减小其危害。
　　

如何选择缓冲液PH值？
　　在选择缓冲液PH值之前，应先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka两个PH值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰，从HH公式：PH=Pka+log([A-]/[A])得知，溶液 PH值高于或低于Pka两个单位，化合物中99%以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。
　　如果选择不到合适的，样品的pKa与流动相的pH非常接近，那么流动相pH微小的变化，都会引起样品保留时间较大的变动。

举例：检测大肠杆菌发酵液中有机酸（主要为乙酸）

流动相的选择依据，流动相的pH值的主要取决于被分离的有机酸的pKa值，乙酸的解离常数是4.76，所用柱子能承受的最低pH值是2，在酸性流动相环境中，如果允许乙酸有1%的离子状态存在，则可预测流动相的pH值。

pH = pKa + Log [Ac^-]/[HAc] = 4.76 + Log 1% = 2.76

由上式可知，流动相的pH值应该是pH 2~2.76之间。配制pH=2.2，2.4，2.6，2.8四种梯度流动相，最后选择pH=2.2的流动相。pH值越小，酸的解离越少，峰形越好。反相C₁₈柱的容许pH范围2.0～8.0，而且磷酸盐在2.1处缓冲容量最大（由于篇幅所限，液相条件探索的色谱图省略处理）。

但是，当化合物只有氨基时，那就十分简单了，大多数氨基化合物pH值小于9时都被质子化，所以所有pH值在7或更低的溶液均适合应用。你也许会问水的 PH值大约是7，为什么还用缓冲盐？因为缓冲盐有助于增加方法的可靠性，以及色谱峰的尖锐性，PH值的降低有助于氨基化合物保留的减弱，减小化合物与硅胶表面硅羟基的作用，而使峰更尖锐，任何缓冲液均可应用于氨基化合物的分析，但我们认为pH值等于3的磷酸钾盐最适合用于氨基化合物的分析。在一般情况下，它是含羧基和氨基化合物分析中最好的缓冲液，并且我们认为在氨基化合物分析中钾盐比钠盐更好.

应用缓冲液PH值来调节方法选择性?
　　如前面提到的，氨基化合物的保留值随pH的减小而降低，这个特性可以用来调节方法的选择性，如果两个化合物共流出，一个含有氨基，适当改变pH值就可以用来分离这一物质对。由于可离解化合物的选择性依靠pH值，所以变化pH值也可以用来鉴别未知化合物的官能团，如果pH值变小，出峰便快，则化合物中可能存在氨基，当pH变大,化合物出峰很快，或流出在死时间处，化合物可能是一种羧酸，因为羧基离子化后流出大大快于比质子化的中性化合物。
　　

小结：
　
正确选择缓冲溶液及其pH，在反相液相色谱方法中对于优化尖峰、检出限、以及获得稳定的保留时间等都十分重要，如果知道化合物官能团信息和化合物的Pka值，那么这一过程将变得十分简单。

从摇瓶、发酵有机酸图谱中我们可以看出这七种有机酸得到很好的分离效果，但发酵罐发酵干扰物质比较多，在样品萃取后干扰峰仍然比较多，但几种主要酸的峰分离效果较好（乙酸、柠檬酸、丙酸等）

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2010/12/19 17:02:50 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

补充：怎样为离子对试剂选择缓冲液

　　为应用离子对试剂的方法选择缓冲液的过程是相似的，离子对试剂例如四丁基铵的盐，十四烷基磺酸钠等，在流动相中可与化合物中可离解的官能团配对，在缓冲液中以离子形式存在的化合物就需要应用离子对试剂。

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2010/12/19 17:06:33 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

再补充：

在选择缓冲液PH值之前，应先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka两个PH值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰，从HH公式：PH=Pka+log([A-]/[A])得知，溶液PH值高于或低于Pka两个单位，化合物中99%以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。显示的是它的离子形式和中性化合物的转变，苯甲酸的Pka等于4.2，理论上由HH公示得知，当溶液PH值等于 2.2时，99%的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等于6.2时99%的苯甲酸以离子形式存在，所以当缓冲液PH值等于2.2时，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱

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2010/12/19 17:07:46 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

流动相的pH值
　　采用反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在;对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液;分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。
　　注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺(如三乙胺)又称为减尾剂或除尾剂。

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