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| 本实验讲义是在接受了去年实验的成功经验和失败的教训的基础上编写的。实验的名字叫“分子生物学技术综合实验”，原来是想把它设计成一个彼此连贯、前后呼应的系列实验。但由于经费和条件的限制，还是放弃了这个念头。 实验分成两个部分：前一部分是DNA的操作，主要是DNA片段的亚克隆的方法；后一部分是蛋白的操作，主要是凝胶电泳和免疫杂交。两个部分的分量大致相当，但后一部分做起来对学生的收获可能更大些，因为很少有本科生能一个人原原本本地亲手做一做免疫印迹实验的。它的操作虽然并不复杂，但成本却很高，特别如果使用的是从公司购买的抗体的话。 实验讲义在文字上，主要参考了魏群主编的《分子生物学实验指导》，而在实质内容上，DNA操作部分更多的是参考了萨姆布鲁克等人的《基因克隆》第二版的中译本，蛋白质部分主要是根据自己平日工作的积累。 希望同学们能够珍惜这次机会，认真地做实验，真正地掌握些实实在在的实验操作技能，为今后的学习和工作打下基础。千万不要忽视实验技能的培养和提高，生物学的成就毕竟主要是通过实验干出来的。 转化后细菌菌落的快速裂解及质粒大小的检查 一般情况下，可以根据质粒的大小来确定它是否带有插入片段。以下方法足以产生在琼脂糖凝胶的单个泳道上加样所需的DNA量。操作方法如下： 1. 使转化得到的细菌在含有氨卞青霉素的琼脂培养基(LB)上生长至菌落直径达1mm左右。 2. 用灭菌的牙签挑取单菌落的一小部分，在含氨卞青霉素的LB琼脂平板上划线。至少挑选20个左右的菌落照此划线，平板于37℃培养过夜，然后保存于4℃，直到相应菌落的回收。 3. L 灭菌的10mmo1／Lm在划线培养的同时，将每一菌落的剩余部分用牙签一一转移并洗脱到事先加有50 EDTA(pH8.0)的1.5mL离心管中。 L配制的0.2mo1／Lm 4. 每管加50 NaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液，振荡30秒。 5. 于70℃温育5分钟，然后冷却到室温。 L 2mol／Lm 6. 加3 KCl、0.2％溴酚蓝的溶液，振荡30秒。 7. 冰浴5分钟。 8. 用微量离心机于4℃以12000g离心3分钟，使细菌碎片的沉淀。 9. L上清液加入样品槽内(5×2.5mm，长×宽)。m制备1％的琼脂糖凝胶(5mm厚)，将50 10. 染料迁移到凝胶全长的2／3—3／4时，于室温将凝胶放入溴化乙锭溶液(0.5ug／mL水溶液)中，浸泡20—30分钟。 11. 紫外灯下观察、拍照。 通过与同时点样的载体质粒的比较，不难发现重组子：比载体质粒迁移慢的很可能是含有插入片段的重组DNA。可从保存于4℃的重新划线的平板上挑出相应的菌落，接种于2mL含抗菌素的LB培养液中培养过夜，然后提取质粒，用做重组时相同的限制酶做酶切鉴定。重组子应该可以切下预期大小的插入片段。 实验六 GFP在大肠杆菌中的诱导表达和细菌蛋白的超声破碎抽提 [实验原理] 把含有外源基因的表达载体转化的大肠杆菌在有相应抗菌素和诱导物的条件下培养，可以诱导外源蛋白在大肠杆菌中表达。利用溶菌酶、反复冻融或超声波破碎的方法将诱导培养的细菌的细胞壁破碎后，可使那些可溶性的外源蛋白释放出来，再利用硫酸铵沉淀、蛋白质层析技术和制备电泳等方法能够将外源蛋白分离纯化出来，供进一步的研究使用。有些过量表达的外源蛋白往往在细菌中形成不溶性的包涵体，细胞破碎、离心后这些包涵体出现在沉淀中，这样的蛋白需要用高浓度的尿素或SDS变性处理后才能溶解。超声破碎时要产生大量的热，会引起蛋白的变性。为了避免产生高温，超声时一般使用间隔的脉冲处理，而且应在冰浴中进行。本实验使用超声波破碎法抽提蛋白，因为表达的外源蛋白GFP（绿色荧光蛋白）比较耐高温，故省去了冰浴。 [ 仪器、试剂和材料] 1、pGLO转化的大肠杆菌 2、LB培养液 3、氨卞青霉素 4、L-阿拉伯糖 5、硫酸铵 6、细菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA， pH 8.0) 7、恒温摇床 8、小型高速离心机 9、超声波组织细胞破碎仪 10、玻璃试管，三角瓶 11、1.5mL和5mL 塑料离心管 12、“枪”，枪头 [ 实验操作] 1、大肠杆菌的诱导培养： 从Amp+/LB琼脂板上培养的pGLO转化的大肠杆菌中挑取2-3个菌落，接种于Amp+（终浓度为50微克/mL）的5mL LB的玻璃试管中，培养两管，放恒温摇床中，37℃培养过夜。将其中一管保存于4℃，另一管所有5mL的培养物加到装有150mL的LB培养液的三角瓶中，加入L-阿拉伯糖干粉150毫克和氨卞青霉素（终浓度为50微克/mL），恒温摇床上37℃振荡培养过夜 2、超声破碎抽提： 将诱导培养的大肠杆菌培养物转移到数只5mL离心管中，8000转/分离心5分钟，倾去上清液后，在沉淀上面再加培养物，继续离心，将所有的培养物都收集在一起。每管中加入1.5mL的细菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA， pH 8.0），用枪吹打，使沉淀悬浮。将离心管放在小试管架上，将超声波破碎仪的金属头插到离心管中，调整好试管的位置后关上超声破碎仪的门，打开仪器的电源，对每只离心管中的菌体进行超声破碎。条件：功率80瓦，工作2秒，间隔2秒，每一次处理5个循环。 4 次处理后，8000转/分离心5分钟。取出离心管，在紫光灯下观察离心管底的沉淀，如果大量沉淀仍然为绿色，则说明破碎不够，继续按前面方法再超声处理2次，然后再离心。如果仅有很少的绿色沉淀或根本看不到，说明破碎完全。 小心吸出上清液，集中放到干净的5mL离心管中，体积不要超过4mL，逐步地加入少量硫酸铵干粉，使达到饱和，8000转/分离心5分钟。将离心管取出，放紫光灯下观察，沉淀中应该能看到明亮的绿色荧光。将上清液倾去，蛋白沉淀物4℃保存，或冷冻于-20℃ |
| 本实验讲义是在接受了去年实验的成功经验和失败的教训的基础上编写的。实验的名字叫“分子生物学技术综合实验”，原来是想把它设计成一个彼此连贯、前后呼应的系列实验。但由于经费和条件的限制，还是放弃了这个念头。 实验分成两个部分：前一部分是DNA的操作，主要是DNA片段的亚克隆的方法；后一部分是蛋白的操作，主要是凝胶电泳和免疫杂交。两个部分的分量大致相当，但后一部分做起来对学生的收获可能更大些，因为很少有本科生能一个人原原本本地亲手做一做免疫印迹实验的。它的操作虽然并不复杂，但成本却很高，特别如果使用的是从公司购买的抗体的话。 实验讲义在文字上，主要参考了魏群主编的《分子生物学实验指导》，而在实质内容上，DNA操作部分更多的是参考了萨姆布鲁克等人的《基因克隆》第二版的中译本，蛋白质部分主要是根据自己平日工作的积累。 希望同学们能够珍惜这次机会，认真地做实验，真正地掌握些实实在在的实验操作技能，为今后的学习和工作打下基础。千万不要忽视实验技能的培养和提高，生物学的成就毕竟主要是通过实验干出来的。 转化后细菌菌落的快速裂解及质粒大小的检查 一般情况下，可以根据质粒的大小来确定它是否带有插入片段。以下方法足以产生在琼脂糖凝胶的单个泳道上加样所需的DNA量。操作方法如下： 1. 使转化得到的细菌在含有氨卞青霉素的琼脂培养基(LB)上生长至菌落直径达1mm左右。 2. 用灭菌的牙签挑取单菌落的一小部分，在含氨卞青霉素的LB琼脂平板上划线。至少挑选20个左右的菌落照此划线，平板于37℃培养过夜，然后保存于4℃，直到相应菌落的回收。 3. L 灭菌的10mmo1／Lm在划线培养的同时，将每一菌落的剩余部分用牙签一一转移并洗脱到事先加有50 EDTA(pH8.0)的1.5mL离心管中。 L配制的0.2mo1／Lm 4. 每管加50 NaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液，振荡30秒。 5. 于70℃温育5分钟，然后冷却到室温。 L 2mol／Lm 6. 加3 KCl、0.2％溴酚蓝的溶液，振荡30秒。 7. 冰浴5分钟。 8. 用微量离心机于4℃以12000g离心3分钟，使细菌碎片的沉淀。 9. L上清液加入样品槽内(5×2.5mm，长×宽)。m制备1％的琼脂糖凝胶(5mm厚)，将50 10. 染料迁移到凝胶全长的2／3—3／4时，于室温将凝胶放入溴化乙锭溶液(0.5ug／mL水溶液)中，浸泡20—30分钟。 11. 紫外灯下观察、拍照。 通过与同时点样的载体质粒的比较，不难发现重组子：比载体质粒迁移慢的很可能是含有插入片段的重组DNA。可从保存于4℃的重新划线的平板上挑出相应的菌落，接种于2mL含抗菌素的LB培养液中培养过夜，然后提取质粒，用做重组时相同的限制酶做酶切鉴定。重组子应该可以切下预期大小的插入片段。 实验六 GFP在大肠杆菌中的诱导表达和细菌蛋白的超声破碎抽提 [实验原理] 把含有外源基因的表达载体转化的大肠杆菌在有相应抗菌素和诱导物的条件下培养，可以诱导外源蛋白在大肠杆菌中表达。利用溶菌酶、反复冻融或超声波破碎的方法将诱导培养的细菌的细胞壁破碎后，可使那些可溶性的外源蛋白释放出来，再利用硫酸铵沉淀、蛋白质层析技术和制备电泳等方法能够将外源蛋白分离纯化出来，供进一步的研究使用。有些过量表达的外源蛋白往往在细菌中形成不溶性的包涵体，细胞破碎、离心后这些包涵体出现在沉淀中，这样的蛋白需要用高浓度的尿素或SDS变性处理后才能溶解。超声破碎时要产生大量的热，会引起蛋白的变性。为了避免产生高温，超声时一般使用间隔的脉冲处理，而且应在冰浴中进行。本实验使用超声波破碎法抽提蛋白，因为表达的外源蛋白GFP（绿色荧光蛋白）比较耐高温，故省去了冰浴。 [ 仪器、试剂和材料] 1、pGLO转化的大肠杆菌 2、LB培养液 3、氨卞青霉素 4、L-阿拉伯糖 5、硫酸铵 6、细菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA， pH 8.0) 7、恒温摇床 8、小型高速离心机 9、超声波组织细胞破碎仪 10、玻璃试管，三角瓶 11、1.5mL和5mL 塑料离心管 12、“枪”，枪头 [ 实验操作] 1、大肠杆菌的诱导培养： 从Amp+/LB琼脂板上培养的pGLO转化的大肠杆菌中挑取2-3个菌落，接种于Amp+（终浓度为50微克/mL）的5mL LB的玻璃试管中，培养两管，放恒温摇床中，37℃培养过夜。将其中一管保存于4℃，另一管所有5mL的培养物加到装有150mL的LB培养液的三角瓶中，加入L-阿拉伯糖干粉150毫克和氨卞青霉素（终浓度为50微克/mL），恒温摇床上37℃振荡培养过夜 2、超声破碎抽提： 将诱导培养的大肠杆菌培养物转移到数只5mL离心管中，8000转/分离心5分钟，倾去上清液后，在沉淀上面再加培养物，继续离心，将所有的培养物都收集在一起。每管中加入1.5mL的细菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA， pH 8.0），用枪吹打，使沉淀悬浮。将离心管放在小试管架上，将超声波破碎仪的金属头插到离心管中，调整好试管的位置后关上超声破碎仪的门，打开仪器的电源，对每只离心管中的菌体进行超声破碎。条件：功率80瓦，工作2秒，间隔2秒，每一次处理5个循环。 4 次处理后，8000转/分离心5分钟。取出离心管，在紫光灯下观察离心管底的沉淀，如果大量沉淀仍然为绿色，则说明破碎不够，继续按前面方法再超声处理2次，然后再离心。如果仅有很少的绿色沉淀或根本看不到，说明破碎完全。 小心吸出上清液，集中放到干净的5mL离心管中，体积不要超过4mL，逐步地加入少量硫酸铵干粉，使达到饱和，8000转/分离心5分钟。将离心管取出，放紫光灯下观察，沉淀中应该能看到明亮的绿色荧光。将上清液倾去，蛋白沉淀物4℃保存，或冷冻于-20℃ |
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