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主题：【转帖】电泳图片光密度分析原理与方法（2）

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发表于：2012/04/29 15:23:13 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1. 旋转图片rotate image。
大家也许没把这当回事。也许是一般拍摄的照片是正好不需要旋转的。对分析软件来说，电泳图片的方向是有要求的，就是加样孔必须在图片正上方，而且必须保持泳道与条带的方向横平竖直。如果不是，就必须旋转图片调正。
2. 选择泳道位置lanes。
似乎就是用一个矩形框把一个个泳道给框起来。不必全选的，测哪几个泳道就框哪几个。
3. 选择条带位置 bands。
在泳道里再截出一个框把条带给框住。与泳道一样，只需框住需要测量的条带。
在选择泳道与条带时，软件可以自动选择，但是一般情况下，这个功能没用。还是自己手工选择比较方便。
软件大多会有一个line profile图来帮助选择条带范围，这个图上面的曲线表现的是泳道上的光密度分布，一个峰表现的就是一个条带，峰顶是条带位置，条带的范围就是这个峰的两个山脚。会有一对方括号形状来表示条带范围，要用鼠标拖这对方括号到相应的山脚处。
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2012/4/29 15:23:34 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

4. 设定扣背景方式 background correction。
这一点绝不能忽略，扣背景方式也有多种选择，选择joining valleys方式是比较好的。如果不扣背景，会导致大得离谱的误差。
　　注意条带峰的基线下面，其背景值与条带本身的面积差不多大了。对这张照片来说，如果不扣背景，测量的光密度值会增加一倍左右。
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2012/4/29 15:24:52 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

5. 设置marker
跑电泳时都要跑个marker的。这个marker实际上就是测量分子量的参照。软件可以利用这个参照来测量各条带的分子量。这个操作会罗索一点。需要作的是：
a. 指定marker泳道。一般会默认第一泳道是marker。但实际跑电泳的时候，把marker放到别的泳道上也许更好。原则是让各样品泳道尽量与marker泳道靠得近点。从这个角度来说，marker放在中间泳道比放在边上更好。
b. 指定marker的分子量序列，就是把marker各条带的分子量一个个输入到程序里。
c. 把marker分子量数值与marker泳道上的条带一一对应起来。

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2012/4/29 15:26:32 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

6. 看结果。
这也算是一个操作步骤？算。作好了上面的选择之后，结果就自动计算出来了。但是一个图片的测量数据太多了，以至于很多人看着结果表单不知所措，哪个数据才需要的呢？见过一款软件真的很BT，能显示好几页没用的测量数据。想找到需要的数据挺费事的。
第一个要看的就是各条带的数据在哪个位置。一般的结果表单会把每个泳道的数据排成一列显示，如果要看第三泳道的第二个条带的数据，就在表单的第三列第二行上找数据。
第二个要看的是分子量数据，在表单上会标注为molecular weight 或者M.W.。实际测到的分子量数值不会是完全相同的。一般只要相差不超过3%，就可以认为其属于相同分子量。
第三个要看的是条带的光密度值。这个最罗索。会有一大堆各种各样的数据来迷惑你，让你不知道哪个才是。其实只有一个数据是有用的：IOD。有的软件上用I-vol来表示。其他的统统不必管它。
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2012/4/29 15:27:53 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

光密度值是一个相对值，原则上，只有同一张电泳图片上的分子量相同的条带之间才能进行比较。但是分子量不同的条带之间也勉强可以作一个量的比较。
测量到了各条带的分子量与光密度，剩下的就不是图像分析的事情了。自己把数据抄到excel里去作柱状图。或者作统计计算。
大家可能注意到我没提光密度校正。是的，不是没作，而是程序已经自动作了。在你选择条带的时候，程序会自动选择相应的光密度较正方式。所以我们就不需要操心这个了。需要注意的是，所有的电泳图片能分成两类，一类是黑色背景，亮条带。另一类是白色背景，暗条带。一般程序会自动识别这两种类型，自动作好光密度校正。不过有时候图片不典型，也会让程序糊涂起来。程序弄错的时候，会表现在line profile上，你会发现上面的峰颠倒过来了。这时候就得找相应的设置。一个是指定一下分析任务，在DNA与protein之间正确地选择一个。另一个是在条带选择窗口里找“bright background, dark band”及“dark background, bright band”，在这两者之间选择一个正确的。

我这里使用的是gel-pro程序的界面以及UVP的凝胶成像系统。本讲座的重点并不在于具体如何操作软件，而是讲解为什么要作这的操作。关于这个软件的操作另有详细的操作演示。其他的设备及软件使用方法在原理上是一样的。操作方法就得自己去学了。

图片：选错了条带亮暗的类型后，line profile曲线上的峰倒过来了。

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