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主题：【分享】电泳图的阅读体会－（心得）初学者必读

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发表于：2012/05/05 11:57:21 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

电泳后出现异常情况，最后发现系配错胶浓度，才算有点真正理解琼脂糖凝胶电泳！或者说真正看懂书，可惜这些细节就是没人教，可能就是所谓的个人领会。在这里共享，以助初学者理解。

本来做实验就不是专业，这几个月一边做一边学。真希望能看到高手的体会、分享。但反过来想想，要是我很懂了，可能会以为这些很简单大家都懂，也不会发帖提醒。所以在这里慢慢总结这次错误。自己思考，也希望多少对大家有帮助。

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2012/5/5 11:57:45 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

基本概念（出现错误后才真正能理论联系实际）

溴化乙锭（EB）是制胶时混在胶中，载样缓冲液（含溴酚蓝染料）是电泳前才同样本混合的。

正确电泳后拍的照片，仔细观察可以发现，点样孔侧（阴极）较白，而另一侧则较黑，两者之间有一分界线。其实显示白色的胶内含EB，而黑色的胶内则EB已迁移，所以EB是胶呈白色的原因。此分界线为EB在电场作用下向阴极移动的前沿。分界线的点样孔侧有一排黑色条带，只有在点过样本的点样孔列出现，无样本的列则无此黑色条带。此黑色条带为溴酚蓝在照片中的位置。

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2012/5/5 11:58:13 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

电泳时，点样孔侧通常为阴极，而对侧则为阳极。蛋白带负电荷，所以向阳极移动，溴酚蓝也带负电荷，同样向阳极移动。溴酚蓝在不同浓度的胶内的移动速度是不同的。在0.5－1.4%浓度、0.5 X TBE的胶内其移动速率约与300bp的线状双链DNA相似。但我用的胶是3%，所以与书上不同，与更小bp的线状双链DNA相似。胶内的EB带正电荷，向阴极也就是点样孔侧移动。溴酚蓝是在电泳时起到指示电泳带的作用，就是肉眼在胶上看到时的染色条带，而EB与DNA结合才是在紫外线下发光的原因。如果电泳时间过长，会导致EB向阴极移动过多，甚至全部跑出凝胶。这样的话，含样本条带的胶内没有EB，在紫外线下电泳条带就不能发光。

错误就这样发生了，配错胶浓度，可能是1.5%，导致在同以前一样的电泳时间内，条带跑得更远，跑到EB已经向阴极移走，所以不含或含很少EB的胶内，于是在紫外线下看不到条带。

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2012/5/5 11:59:11 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

这时想要补救，以显示条带，就需要在含0.5ug/ml溴化乙锭（EB）液中浸泡约30－45分钟。

因为与DNA结合的EB呈现更高的荧光，比游离在胶中的EB发的荧光高出20－30倍，所以条带会比背景亮。在EB存在的情况下，线状DNA的电泳迁移率降低15%，其实当凝胶中没有EB时，凝胶中的DNA条带更清楚。在胶中掺EB是为了节约时间，电泳结束马上可以看到结果。

有时候电泳照片拍得好，在溴酚蓝远侧还可见到与溴酚蓝条带平行的稀疏的暗区，但是Marker处是没有的，这个条带是什么？二甲苯氰FF应该在近侧，而且Marker中含二甲苯氰FF和甘油。是蔗糖，Ficoll？目前不敢确认。

凝胶浓度不同时Marker在照片上的排列也有变化，像我做错了胶，浓度低了，Marker的明显表现就是第一条带离点样孔远了好多。这个现象有助于及时找到错误原因，就是胶的浓度问题。其它电泳缓冲液错误的表现就得等再出错才知道了。也请有出过此类错误的朋友提个醒。

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huanshi185

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2012/8/26 17:29:08 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

说几句我的看法吧

1. 一般大家都用1%的琼脂糖，其实很少用其他的，所以一般不会出现配胶的浓度问题。
2. 即使配错了，问题也不大，一般还是建议看看溴酚蓝的条带，大约300bp，有的上样缓冲液中有二甲苯氰，大约4kb，一般根据这两个条带大致做个判断
3. 关于电泳缓冲液错误，这个真没遇到过，一般跑胶这一部分都是以污染区处理的，大家也知道EB的潜在致癌性，所以都是专用；如果出现错误，关键要看你用那个的溶液导电性的问题，TAE、TBE都可以，就是一个缓冲能力的问题，另外缓冲液离子浓度高，会导致整个电场强度比较大，电泳速度快，发热高，这个要注意。

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2012/8/26 17:30:06 Last edit by huanshi185