二. 追踪污染源
如果不慎发生污染情况,应从下面几条出发,逐一分析,排除污染。
(一)设立阴阳性对照:有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时,应选择扩增弱,且重复性好的样品,因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列,反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照,100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重,因为PCR敏感性极高,可以从其它方法(Sourthern 印迹或点杂交等)检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外,每次扩增均应包括PCR体系中各试剂的时机对照,即包括PCR反应所需的全部成分,而不加模板DNA,这对监测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果,就是某一种或数种试剂被污染了。此时,要全部更换一批新的试剂进行扩增,扩增时设立不同的反应管,每一管含有一种被检测试剂,在检出污染试剂后,应马上处理。
(二)环境污染:在排除试剂污染的可能性外,更换试剂后,若不久又发现试剂被污染了,如果预防措施比较严密,则考虑可能为环境污染。
1. 模板提取时真空抽干装置;
2. 凝胶电泳加样器;
3. 电泳装置;
4. 紫外分析仪;
5. 切胶用刀或手术刀片;
6. 离心机;
7. 冰箱门把手,冷冻架,门把手或实验台面等;
此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。1)用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源;2)0.1ml去离子水浸泡;3)取5ml做PCR实验;4)电泳检测结果。
8. 气溶胶。如果经过上述追踪实验,仍不能查找到确切污染源,则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的,此时就应该更换实验场所,若条件不允许,则重新设计新的引物(与原引物无相关性)。