1 细胞复苏

于-80°C 低温冰箱中取出冻存的人乳腺癌细胞 MCF-7，马上放入 37°C 水浴锅中。待冻存管中的冰全部融化后，以 1000 rpm 的转速离心 5 min 后转移至超净工作台中，去除上清液并加入 1 mL 的新鲜培养基，轻轻吹打使其混和均匀，将混匀后的细胞悬液转移到培养瓶中，再加入适量的培养基，放入 37°C，5% CO 恒温培养箱中培养。培养过夜的细胞贴壁后去除旧培养基，加入适量的 PBS 缓冲溶液清洗细胞表面，再重新加入适量的新鲜培养基继续培养至覆盖表面 80%左右。

2 细胞传代

取培养至覆盖培养皿表面 80%的细胞，去除培养基，取适量的 PBS 缓冲溶液清洗细胞表面，将 PBS 吸出后加入 0.25%的胰蛋白酶，置于 37°C 的环境下消化。在倒置显微镜下观察，当发现细胞收缩相互分离时，加入新鲜培养基，缓慢吹打使细胞脱落，悬浮于培养基中。取细胞悬液 1000 rpm 离心 5 min，再次加入适量新鲜培养基混匀后传至新的培养皿中，放入 37°C，5% CO 2 恒温培养箱中培养。传代后的细胞一部分用于培养基收集，分离外泌体，另一部分冻存后备用。

3 含外泌体培养基收集

首先，将胎牛血清 FBS 于 100,000 g、4°C 条件下超速离心 70 min，得到去除外泌体的培养血清。

在本研究中，将细胞 MCF-7 接种到一个 150 mm 的培养皿中，加入 30 mL 含 10%无外泌体 FBS 的 DMEM 培养基，置于 5% CO 2 的 37°C 培养箱中培养。待细胞生长达到覆盖培养皿 80%以上时，收集细胞培养基。将细胞培养基于 300 g 离心 10 min、2000 g离心 20 min、10000 g 离心 30 min，并用 0.22 μm 过滤器去除细胞、细胞碎片和较大的细胞外囊泡，所得上清液即为待测细胞培养基样品。

4 外泌体的分离

取 4 mL 上述细胞培养基分离过滤，上清液加入 1 mL 的 pH 响应聚合物-抗体复活物溶液，4°C 下温和振摇 1 h。然后加入 1%氨水调节 pH 至 7.5，3000 r/min 离心 10 min，去除上清，得到捕获有外泌体的 pH 响应聚合物沉淀。向沉淀中加入 400 μL 的 PBS 缓冲液，重复洗涤 3 次，加入 5 mg 的 α-环糊精于 4°C 孵育 1 h，以取代 β-环糊精抗体-外泌体复合物。调节 pH 至 7.5，离心取上清，4°C 保存备用。

5 外泌体蛋白质提取和 Western Blot

取富集有外泌体的样品溶液，加入等体积的 RIPA 裂解液（含有 1%的蛋白酶抑制剂），每隔 5 min 振摇一次，冰浴下裂解 30 min。然后加入 Loading buffer，煮沸 5 min，将裂解的蛋白质样品置于-20°C 冰箱中保存备用。

SDS-PAGE 电泳：

（1）实验试剂的配制

1×电泳缓冲液：称取 14.4 g 甘氨酸，3 g Tris，1 g SDS，加入去离子水，搅拌溶解，定容至 1000 mL。

1×转膜液：称取 14.4 g 甘氨酸，3 g Tris，150 mL 甲醇，加入去离子水，搅拌溶解，定容至 1000 mL。

（2）丙烯酰胺凝胶的配制与加样

将制胶玻璃板、制胶器和电泳槽清洗干净，待其干燥后固定，待用；配制 10%的下层分离胶：向烧杯中依次加入 2.7 mL 去离子水，3.3 mL 30%丙烯酰胺，3.8 mL Tris-HCl，0.1 mL 10% SDS，0.1 mL 10% AP，搅拌均匀后加入 0.004 mL TEMED。将上述溶液混合均匀后，小心倒入玻璃板缝隙，注意避免出现气泡，灌入分离胶后在上面加入 1-2 mL超纯水，室温下静置 40 min。待其凝固后去除上层水，配置 5%浓缩胶。方法如下：向烧杯中依次加入 2.7 mL 去离子水，0.67 mL 30%丙烯酰胺，0.5 mL Tris-HCl，0.04 mL 10%SDS，0.04 mL 10% AP，0.004 mL TEMED，混合均匀后倒入玻璃板，立即插入梳子。待上层胶凝固后小心取出玻璃板上的梳子，注意不要破坏加样孔，向电泳槽中加入足量电泳液，用移液枪吸取 10 μL 处理后的样品至加样孔中，准备电泳。

（3）电泳与转模

连接电源，设置初始电压为 80 V，当样品跑至浓缩胶与分离胶界面时将电压调至120 V，直至样品跑至分离胶的底部，停止电泳。待电泳完成后，拆除玻璃板，取下凝胶并转移至转膜夹上，按顺序组装好转膜夹后放入转膜槽中，加入配好的转膜液，冰浴下 250 mA 转膜 1 h。

（4）封闭、抗体孵育及显色

转膜结束后，将膜放入含5% BSA的TBST溶液中室温下封闭1 h。用配好的一抗4°C孵育过夜，TBST 溶液清洗 3 次，每次 10 min，用配好的二抗室温孵育 1 h，再次用 TBST溶液清洗 3 次，每次 10 min。

将漂洗后的膜与 ECL 发光液孵育，置于凝胶成像仪的托盘中，调整合适位置，用BIO-RAD 凝胶成像仪显影。

5 SDS-PAGE 与免疫印迹分析

首先将细胞培养液、pH 响应聚合物-抗体复合物分离外泌体后的上清液、一次洗涤、二次洗涤、三次洗涤上清液以及外泌体洗脱液分别裂解后，用 10%的 SDS-PAGE 分离，待样品电泳至分离胶底部时，取出分离胶用考马斯亮蓝染色 1 h，蒸馏水洗涤 3 次后用脱色液脱色，结果如图 3-2 所示。通过对比图中 Elute 泳道及其它泳道可以明显看出分离后的外泌体样品（Elute）在 70 kDa 处大量杂蛋白质的含量明显降低。

将外泌体标志性蛋白质 CD9、CD81、TSG101、HSC70 抗体均按 1:500 稀释，HRP-羊抗兔抗体以 1:10000 稀释后用于免疫印迹试验。实验结果如图 3-3 所示，外泌体标志性蛋白质 CD9、CD81、TSG101 和 HSC70 的含量均明显高于分离富集前及分离后上清液中的含量，证明外泌体已被成功地分离。

6 外泌体回收率测试

取 50 mL 的细胞培养基样品，在 100,000 g 超速离心 70 min 后，所得外泌体用 200 μL的 PBS 重悬，取 10 μL 加入 1 mL PBS 稀释，作为外泌体回收率测试标准品。

取 1 mL 的 pH 响应聚合物-抗体复合物溶液加入 10 μL 外泌体回收率测试标准品，在 4°C 下分别孵育 5 min、10 min、15 min、30 min、60 min，调节 pH 至 7.5 使聚合物析出后离心，400 μL PBS 洗涤三次，调节 pH 至 6.5 使聚合物溶解后加入 α-环糊精取代后孵育 1 h，再次调节 pH 至 7.5 使聚合物析出后离心，NTA 法测试上清中外泌体的浓度，并计算外泌体标准品的回收率。

外泌体回收率测试标准品浓度为 2.86e+08±3.27e+06 particles/mL，外泌体颗粒直径主要集中在 100-200 nm（图 3-4）。当 pH 响应聚合物-抗体复合物材料分别与外泌体标准品孵育 5 min、10 min、15 min、30 min、60 min 后，用 NTA 法测试分离后外泌体的浓度。如图 3-5 所示，当孵育时间为 30 min 时外泌体回收率即可达 80.4±2.9%，孵育时间继续增加至 60 min，外泌体回收率可达 87.0±4.6%。

7 血清样品中外泌体的分离

进一步将 pH 响应聚合物-抗体复合物材料用于人血清中外泌体的分离。取 1 mL 的血清样品用 0.22 μm 滤膜过滤，按上述培养基样品的分离法获得血清中外泌体。WesternBlot 结果如图 3-6 所示，经分离后外泌体标志性蛋白质 CD9、CD81、TSG101、HSC70含量均明显高于分离前及分离后上清液中的含量，证明了该方法在血清外泌体的分离中同样取得了较好效果。