主题:【第十三届原创】细胞培养、外泌体分离方法及表征

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细胞培养外泌体分离方法及表征



1 细胞复苏

-80°C 低温冰箱中取出冻存的人乳腺癌细胞 MCF-7,马上放入 37°C 水浴锅中。待冻存管中的冰全部融化后,以 1000 rpm 的转速离心 5 min 后转移至超净工作台中,去除上清液并加入 1 mL 的新鲜培养基,轻轻吹打使其混和均匀,将混匀后的细胞悬液转移到培养瓶中,再加入适量的培养基,放入 37°C5% CO 恒温培养箱中培养。培养过夜的细胞贴壁后去除旧培养基,加入适量的 PBS 缓冲溶液清洗细胞表面,再重新加入适量的新鲜培养基继续培养至覆盖表面 80%左右。

2 细胞传代

取培养至覆盖培养皿表面 80%的细胞,去除培养基,取适量的 PBS 缓冲溶液清洗细胞表面,将 PBS 吸出后加入 0.25%的胰蛋白酶,置于 37°C 的环境下消化。在倒置显微镜下观察,当发现细胞收缩相互分离时,加入新鲜培养基,缓慢吹打使细胞脱落,悬浮于培养基中。取细胞悬液 1000 rpm 离心 5 min,再次加入适量新鲜培养基混匀后传至新的培养皿中,放入 37°C5% CO 2 恒温培养箱中培养。传代后的细胞一部分用于培养基收集,分离外泌体,另一部分冻存后备用。

3 含外泌体培养基收集

首先,将胎牛血清 FBS 100,000 g4°C 条件下超速离心 70 min,得到去除外泌体的培养血清。

在本研究中,将细胞 MCF-7 接种到一个 150 mm 的培养皿中,加入 30 mL 10%无外泌体 FBS DMEM 培养基,置于 5% CO 2 37°C 培养箱中培养。待细胞生长达到覆盖培养皿 80%以上时,收集细胞培养基。将细胞培养基于 300 g 离心 10 min2000 g离心 20 min10000 g 离心 30 min,并用 0.22 μm 过滤器去除细胞、细胞碎片和较大的细胞外囊泡,所得上清液即为待测细胞培养基样品。

4 外泌体的分离

4 mL 上述细胞培养基分离过滤,上清液加入 1 mL pH 响应聚合物-抗体复活物溶液,4°C 下温和振摇 1 h。然后加入 1%氨水调节 pH 7.53000 r/min 离心 10 min,去除上清,得到捕获有外泌体的 pH 响应聚合物沉淀。向沉淀中加入 400 μL PBS 缓冲液,重复洗涤 3 次,加入 5 mg α-环糊精于 4°C 孵育 1 h,以取代 β-环糊精抗体-外泌体复合物。调节 pH 7.5,离心取上清,4°C 保存备用。

5 外泌体蛋白质提取和 Western Blot

取富集有外泌体的样品溶液,加入等体积的 RIPA 裂解液(含有 1%的蛋白酶抑制剂),每隔 5 min 振摇一次,冰浴下裂解 30 min。然后加入 Loading buffer,煮沸 5 min,将裂解的蛋白质样品置于-20°C 冰箱中保存备用。

SDS-PAGE 电泳:

1)实验试剂的配制

电泳缓冲液:称取 14.4 g 甘氨酸,3 g Tris1 g SDS,加入去离子水,搅拌溶解,定容至 1000 mL

转膜液:称取 14.4 g 甘氨酸,3 g Tris150 mL 甲醇,加入去离子水,搅拌溶解,定容至 1000 mL

2)丙烯酰胺凝胶的配制与加样

将制胶玻璃板、制胶器和电泳槽清洗干净,待其干燥后固定,待用;配制 10%的下层分离胶:向烧杯中依次加入 2.7 mL 去离子水,3.3 mL 30%丙烯酰胺,3.8 mL Tris-HCl0.1 mL 10% SDS0.1 mL 10% AP,搅拌均匀后加入 0.004 mL TEMED。将上述溶液混合均匀后,小心倒入玻璃板缝隙,注意避免出现气泡,灌入分离胶后在上面加入 1-2 mL超纯水,室温下静置 40 min。待其凝固后去除上层水,配置 5%浓缩胶。方法如下:向烧杯中依次加入 2.7 mL 去离子水,0.67 mL 30%丙烯酰胺,0.5 mL Tris-HCl0.04 mL 10%SDS0.04 mL 10% AP0.004 mL TEMED,混合均匀后倒入玻璃板,立即插入梳子。待上层胶凝固后小心取出玻璃板上的梳子,注意不要破坏加样孔,向电泳槽中加入足量电泳液,用移液枪吸取 10 μL 处理后的样品至加样孔中,准备电泳。

3)电泳与转模

连接电源,设置初始电压为 80 V,当样品跑至浓缩胶与分离胶界面时将电压调至120 V,直至样品跑至分离胶的底部,停止电泳。待电泳完成后,拆除玻璃板,取下凝胶并转移至转膜夹上,按顺序组装好转膜夹后放入转膜槽中,加入配好的转膜液,冰浴下 250 mA 转膜 1 h

4)封闭、抗体孵育及显色

转膜结束后,将膜放入含5% BSATBST溶液中室温下封闭1 h。用配好的一抗4°C孵育过夜,TBST 溶液清洗 3 次,每次 10 min,用配好的二抗室温孵育 1 h,再次用 TBST溶液清洗 3 次,每次 10 min

将漂洗后的膜与 ECL 发光液孵育,置于凝胶成像仪的托盘中,调整合适位置,用BIO-RAD 凝胶成像仪显影。

5 SDS-PAGE 与免疫印迹分析

首先将细胞培养液、pH 响应聚合物-抗体复合物分离外泌体后的上清液、一次洗涤、二次洗涤、三次洗涤上清液以及外泌体洗脱液分别裂解后,用 10% SDS-PAGE 分离,待样品电泳至分离胶底部时,取出分离胶用考马斯亮蓝染色 1 h,蒸馏水洗涤 3 次后用脱色液脱色,结果如图 3-2 所示。通过对比图中 Elute 泳道及其它泳道可以明显看出分离后的外泌体样品(Elute)在 70 kDa 处大量杂蛋白质的含量明显降低。



将外泌体标志性蛋白质 CD9CD81TSG101HSC70 抗体均按 1:500 稀释,HRP-羊抗兔抗体以 1:10000 稀释后用于免疫印迹试验。实验结果如图 3-3 所示,外泌体标志性蛋白质 CD9CD81TSG101 HSC70 的含量均明显高于分离富集前及分离后上清液中的含量,证明外泌体已被成功地分离。



6 外泌体回收率测试

50 mL 的细胞培养基样品,在 100,000 g 超速离心 70 min 后,所得外泌体用 200 μL PBS 重悬,取 10 μL 加入 1 mL PBS 稀释,作为外泌体回收率测试标准品。

1 mL pH 响应聚合物-抗体复合物溶液加入 10 μL 外泌体回收率测试标准品, 4°C 下分别孵育 5 min10 min15 min30 min60 min,调节 pH 7.5 使聚合物析出后离心,400 μL PBS 洗涤三次,调节 pH 6.5 使聚合物溶解后加入 α-环糊精取代后孵育 1 h,再次调节 pH 7.5 使聚合物析出后离心,NTA 法测试上清中外泌体的浓度,并计算外泌体标准品的回收率。

外泌体回收率测试标准品浓度为 2.86e+08±3.27e+06 particles/mL,外泌体颗粒直径主要集中在 100-200 nm(图 3-4)。当 pH 响应聚合物-抗体复合物材料分别与外泌体标准品孵育 5 min10 min15 min30 min60 min 后,用 NTA 法测试分离后外泌体的浓度。如图 3-5 所示,当孵育时间为 30 min 时外泌体回收率即可达 80.4±2.9%,孵育时间继续增加至 60 min,外泌体回收率可达 87.0±4.6%





7 血清样品中外泌体的分离

进一步将 pH 响应聚合物-抗体复合物材料用于人血清中外泌体的分离。取 1 mL 血清样品用 0.22 μm 滤膜过滤,按上述培养基样品的分离法获得血清中外泌体。WesternBlot 结果如图 3-6 所示,经分离后外泌体标志性蛋白质 CD9CD81TSG101HSC70含量均明显高于分离前及分离后上清液中的含量,证明了该方法在血清外泌体的分离中同样取得了较好效果。

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