转化:重组DNA进入受体的过程叫“转化”,得到重组DNA的细胞叫“转化细胞”。目的基因难以直接送进受体细胞。因为地球上的生物都是长期历史进化的产物,都有保卫自身不受异种生物侵害和稳定地延续自己种族的功能。如果外来的DNA闯进受体细胞,受体细胞就会把它“消灭”。当外来的DNA进入大肠杆菌时,大肠杆菌内部的内切酶就会使其“粉身碎骨”。因此,目的基因的直接导入往往不通。在这种情况下,生物工程师们就要采用DNA重组技术。首先将目的基因与质粒经过内切酶的“裁剪”,然后靠连接酶的作用,将目的基因和质粒(或病毒DNA)重新组合起来形成重组DNA。重组DNA就能在质粒(或病毒DNA)的“带领”下进入受体细胞。
一、基因工程制药的最新进展
基因工程开创制药工业新门类
现代生物技术是通过生物化学与分子生物学的基础研究而快速发展起来的。医药生物技术起步最早、发展最快,目前世界已有2000多家生物技术公司,其中70%从事医药产品的开发。美国已批准30多个生物技术药品上市,还有143种生物技术药物和疫苗正在进行临床试验,另有472种处于不同研究阶段。有资料表明,从1982年重组人胰岛素上市至1991年10年间仅批准该类药品用于治疗21个病种,而近3年新批准用于治疗的品种已达13个,说明生物技术药品的审评速度加快,生物技术工业总体日趋成熟,正在由风险产业变成以商业为动力,以市场为中心的产业。
应用生物技术已有可能产生几乎所有的多肽和蛋白质,基因工程技术的应用已使新药研究方法和制药工业的生产方式发生重大变革。
基因工程药物的研究进展
近十几年来,在利用生物技术制取新药方面取得了惊人的成就,已有不少药物应用于临床。例如人胰岛素、人生长激素、干扰素、乙肝疫苗、人促红细胞生成素(Epo)、GM-集落刺激因子(GM-CSF)、组织溶纤酶原激活素、白细胞介素-2及白介素-11等。正在研究的有降钙素基因相关因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子等140多种。随着生物技术药物的发展,多肽与蛋白质类药物的研究与开发,已成为医药工业中一个重要的领域,同时给生物制剂带来了新的挑战。在实际应用中,基因工程药物受到一定限制,如口服应用时生物利用度低,会受到消化酶的破坏,在胃酸作用下不稳定,在体内半衰期较短等,因此只能注射给药或局部用药。为了克服这些缺陷,已开始改为合成这些天然蛋白质的较小活性片段,即所谓“多肽模拟”或“多肽结构域”合成,又叫“小分子结构药物设计”。这类药物可口服,有利于由皮肤、粘膜给药,用于治疗免疫缺陷症、HIV感染、变态反应性疾病、风湿性关节炎等,其制造成本也更低。这种设计思想也已应用于多糖类药物、核酸类药物和模拟酶的有关研究。小分子药物设计属于第二代结构相关性药物设计,所设计的分子能替代原先天然活性蛋白与特异靶相互作用。
在给药方式的研究方面,对注射用溶液和注射用无菌粉末 (目前上市的多肽蛋白质类药物多为此种剂型),除了继续改进其稳定性外,还通过一些其他技术手段,研制出了化学修饰型、控释微球型和脉冲式给药系统。在非注射途径的给药系统,即包括鼻腔、口服、直肠、口腔、肺部给药方面也已取得重大进展。
第一代和第二代基因工程药物
第一代基因工程药物是针对因缺乏天然内源性蛋白所引起的疾病。应用基因工程技术去扩大这类多肽蛋白质的产量以替代或补充体内对这类活性多肽蛋白质的需要,主要是以蛋白质激素类为代表的,如人胰岛素、胰高血糖素、人生长激素、降钙素、生长激素(somatropin)及α-EPO(Epoetinalfa)等。第二代基因工程药物是根据内源性多肽蛋白的生理活性,应用基因工程技术大量生产这些极为稀有物质,以超正常浓度剂量供给人体,以激发它们的天然活性作为其治疗疾病的药理基础,主要是以细胞生长调节因子为代表的,如G-CSF,GM-CSF,α-IFN,γ-IFN和tPA等。
蛋白质工程药物
应用蛋白质工程技术已获得多种自然界不存在的新型基因工程药物,如CD4,IL-2与毒素结合的杂合蛋白和PIXY321等。
对表达产物的后修饰也是改善蛋白质工程药物药理作用的有效手段。如PEG修饰能有效地改善多肽蛋白质类药物的免疫原性,增加稳定性,延长体内半衰期,减少毒副作用等。PEG-腺苷脱胺酶已投放市场,PEG-天冬酰胺酶,PEG-IL-2,PEG-SOD,均已进入临床。
应用重组DNA技术表达人源性抗体或将抗体小型化(如Fab抗体,单链抗体、单域抗体,分子识别抗体等),与非人源化抗体和完整抗体相比,其免疫原性弱,穿透力强,表达效率高。所以人源化抗体药物和小型化抗体靶向药物正成为肿瘤治疗,自身免疫性疾病,器官移植排斥和艾滋病防治药物的又一研究热点。
基因工程制药的技术路径
利用微生物发酵、动物细胞培养生产基因工程药物是目前工业化生产基因工程药物的最主要方法。 从1982年重组胰岛素批准上市以来,现已有近40种基因工程蛋白质药物投放市场,主要用于治疗癌症、血液病、艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、细菌感染、骨损伤、创伤、代谢病、外周神经病、矮小症、心血管病、糖尿病、不孕症等疑难病。近年来,利用转基因植物生产基因工程疫苗和利用转基因动物乳腺作为生物反应器,生产基因工程人类蛋白质药物的研究也取得重大进展。
1、转基因植物基因工程疫苗
1990年以来利用转基因植物生产基因工程疫苗的研究得到了迅速的发展。利用转基因植物生产基因工程疫苗,是将抗原基因导入植物,让其在植物中表达,人或动物摄入该植物或其中的抗原蛋白质,以产生对某抗原的免疫应答。转基因植物生产疫苗的研究主要集中在烟草、马岭薯、蕃茄、香蕉等植物。
2、转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程药物
利用转基因动物乳腺作为生物反应器,生产基因工程人类蛋白质药物,其成本较微生物发酵、动物细胞培养生产基因工程药物大大降低,故近年不少研究者从事转基因动物乳腺生物反应器生产基因工程药物的研究。乳腺生物反应器生产基因工程药物的基本方法是:将药用蛋白质基因连接到乳汁蛋白质基因的调节元件下游,然后将连接产物显微注射到哺乳动物受精卵或胚胎干细胞,当转基因胚胎长成个体后,在泌乳期药用蛋白质基因表达,从动物乳汁可获得基因工程药物。
1988年开始在大哺乳动物乳腺生物反应器中表达基因工程药物以来,已在以下动物的奶汁中生产出一些人类蛋白质药物:牛奶中有抗凝血酶、纤维蛋白原、人白血清蛋白、胶原蛋白、生育激素、乳缺蛋白、糖基转移酶、蛋白C等,山羊奶中有抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、生育激素、血清白蛋白、组织型溶纤维原激活因子、单克隆抗体,绵羊奶中有抗胰蛋白酶、凝血因子IX、纤维蛋白原、蛋白质C,猪奶中亦有蛋白质C、凝血因子IX、纤维蛋白原、血红蛋白。
乳腺生物反应器生产基因工程药物的研究已取得了一些成功经验,但离商业化生产还有距离。
二、中国基因工程新药简介
外用重组人表皮生长因子衍生物
深圳华生元基因工程发展有限公司开发的外用重组人表皮生长因子衍生物喷剂“依济复”,日前获得国家一类新药证书。这种喷剂将显著促进创伤愈合,大大提高临床治疗水平,是中国基因工程制药领域取得的又一项新成果。
医学研究表明,人表皮生长因子(hEGF)是一种广泛存在于体内的小分子多肽,以自分泌和旁分泌方式分布于体内,多类表皮细胞群的生长对EGF的刺激能作出灵敏反应。实验证明,极微量的hEGF可刺激上皮细胞、成纤维细胞和角化细胞的增殖,促进核酸、蛋白质和羟脯氨酸等
的合成等。
外用重组人表皮生长因子衍生物喷剂(rhEGF)采用DNA重组技术,构建与完善了hEGF大肠杆菌分泌表达细统,在结构和生物学活性等方面与内源性hEGF高度一致。它通过与细胞膜上的受体结合而产生生物学效应,从而激活核内重要基因,调控细胞增殖和激活蛋白质合成。
专家认为,rhEGF可显著促进创面愈合,在普通外科、胃肠道溃疡防治、角膜损伤修复等方面有广阔的应用前景。
人降钙素基因相关肽脂质体片剂
由北京沃华生物大分子应用开发有限公司发明的专利技术,已申报14个国家和地区专利。与其它活性多肽物质一样,降钙素基因相关肽是易于氧化、水解的不稳定生物活性物质,在人体内,特别是在肝、肺等组织内缓慢被降解,半衰期短仅9分钟,所以不能直接作为药品。利用脂质体载体嵌入技术,在成功完成了人降钙素基因相关肽脂质体注射液的基础上,根据临床的需求,进行了该药的剂型改革试验,制备出符合临床要求、患者易于接受的口服片剂,为多肽类药物上市奠定了良好的基础。该片剂具有疗效确切、稳定性好、缓释长效、用药剂量小(pg量)、无毒副作用等特点。对局灶性脑梗塞和全脑缺血都有确切的保护作用,可以做为预防和治疗该病的有效药物。
生物免疫调节剂
5月中旬,湖南九芝堂股份公司开发的新药——斯奇康注射液拿到新西兰,按照国际通行的GCP标准进入临床实验研究。著名国际呼吸病专家贝斯理教授认为,运用生物免疫调节治疗哮喘、慢性支气管炎等呼吸病,国际医学界尚处在动物试验阶段,而中国已经有了大批量临床成功应用的制剂,这是医学界的一大突破。湖南九芝堂公司进行了长达12年的深度开发,采用卡介菌经热酚法提取多糖核酸,配以灭菌生理盐水制成了人体肌肉注射液。经首都医科大学、同济医科大学等30多家医院临床应用证实,该注射液可明显调节人体自身免疫水平,无毒副作用禁忌。该新药已经中国生物制品检定所检定并进入了95版生物制品试行规程,正式命名为卡介菌多糖核酸,取商品名为斯奇康。
降血压肽
一种从牛奶中分离出的、可规模化工业生产的、具有高降血压活性的多肽物质,已由广州市轻工研究所研制开发成功,动物实验已显示出其具有起效时间快、持续时间长、对正常血压无影响的特点,人体临床应用研究正在开展中。
降血压肽是指一类具有血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的多肽物质,这些多肽的氨基酸序列和肽链长度各有不同,但都具有类似的降压功能。
ACE抑制肽广泛存在于各种食物蛋白中,例如牛奶、玉米、明胶以及发酵乳中都有不同的蛋白来源。
合成ACE抑制剂作为药品已在临床治疗高血压中获得成功,而从天然食物蛋白中分离ACE抑制肽,虽然降血压效果不及合成药物强烈,但它对正常血压无影响的特点和来自天然的安全性吸引了众多研究者。据悉,日本从鱼类中获得的降血压肽已经商品化。
另外,利用来自天然食物蛋白的ACE抑制肽开发具有调节血压作用的保健食品,通过长期服用而达到预防、控制、缓解和辅助治疗高血压的目的,也不失为一条安全有效的途径。