色谱条件的优化实验考察了5种不同型号、不同厂家的色谱柱。结果表明，在2orbax C 8(250mm X 4、6mm)上，维生素D2和D3不能分离；在LUNA Cl8(150mm X 4．6mm)、NUCLEOSIL Cl8(250 am x4．6mm)、ALLTIMA C18(150mm X 4.6mm)、ALLTIMA Cl8(250mmX 4．6mm)色谱柱上维生素D 2和D3 的分离度分别为0．722、1．356、1．255和1．666。实验最终选择ALLTIMA C18(250mm X4．6mm)色谱柱作为分离柱。考察了乙腈、甲醇、四氢呋喃等多种溶剂的单相、两相或三相体系作为流动相时，维生素D 2、维生素D3 的分离效果。结果表明，乙腈单相中维生素D2 、维生素D3 的分离度大于2，但保留时间长达30rain，不利于快速检测。甲醇作为流动相时，维生素D2，、维生素D3的保留时间只有10min左右，但两组分得不到完全分离。通过优化甲醇和乙腈的体积比，最后选择甲醇：乙腈=90：10作为流动相。此时，两组分能达到基线分离，保留时间11～12min。四氢呋喃：乙腈=18：82作为流动相时，两组分也能达到基线分离，考虑到四氢呋喃的价格和毒性均高于甲醇，所以方法特性研究中不再考虑该体系。
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