细胞核与线粒体的分级分离
一、原理
细胞内不同结构的比重和大小都不相同,在同一离心场内的沉降速度也不相同,根据这一原理,常用不同转速的离心法,将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆,在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离,其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步,这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)低温条件下,将组织放在匀浆器中,加入等渗匀浆介质(即0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分 级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗 粒沉淀,再用较高的转速,将浮在上清液中的颗粒沉淀下来,从而使各种细胞结构,如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中,所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是 纯的最重的颗粒,须经反复悬浮和离心加以纯化。
分析 分级分离得到的组分,可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。
二、细胞核的分离提取
(一)操作步骤
1.用颈椎脱位的方法处死小白鼠后,迅速剖开腹部取出肝脏,剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中,反复洗涤,尽量除去血污,用滤纸吸去表面的液体。
2.将湿重约1g的肝组织放在小平皿中,用量筒量取8ml预冷的0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙溶液,先加少量该溶液于平皿中,尽量剪碎肝组织后,再全部加入。
3.剪碎的肝组织倒入匀浆管中,使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中,左手持之,右手将匀浆捣杆垂直插入管中,上下转动研磨3~5次,用3层纱布过滤匀浆液于离心管中,然后制备一张涂片①,做好标记,自然干燥。
4.将装有滤液的离心管配平后,放入普通离心机,以2500rpm,离心15分钟;(1)缓缓取上清液,移入高速离心管中,保存于有冰块的烧杯中,待分离线粒体用;(2)同时涂一张上清液片②做好标记,自然干燥;(3)余下的沉淀物进行下一步骤
5.用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙溶液悬浮沉淀物,以2500rpm离心15分钟弃上清,将残留液体用吸管吹打成悬液,滴一滴于干净的载玻片上,涂片③,自然干燥。
6.将①、②、③涂片用l%甲苯胺兰染色后盖片即可观察。
(二)结果
分别于高倍镜下观察三张涂片,描述镜下所见。
三、高速离心分离提取线粒体
(一)操作步骤
1.将装有上清液的高速离心管,从装有冰块的烧杯中取出,配平后,以17000rpm离心20分钟,弃上清,留取沉淀物。
2.加入0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙液lml,用吸管吹打成悬液,以17000rpm离心20分钟,将上清吸入另一试管中,留取沉淀物,加入0.1ml 0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙溶液混匀成悬液(可用牙签)。
3.取上清液和沉淀物悬液,分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片),各滴一滴0.02%詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟。
(二)结果
油镜下观察,颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。
那么,R的阻遏机制是什么?
Barbara Krummel and Michael Chamberlin提出一种解释:R阻断了起始转录复合物向延伸状态的转变。换句话说,R把RNAP困在起始状态,只能合成很短的转录体。
Jookyung Lee and Alex Goldfarb为这一解释提供了实验证据。应用了run-off转录方法,使用一旦123bp DNA(含lac控制区和lacZ基因的起始部分)。先将R与DNA一起孵育10min,让R-O结合。再加RNAP,20min后(让开放型启动子复合物形成)加heparin。Heparin能与游离的RNAP或与DNA结合不紧密的RNAP结合,抑制RNAP与启动子结合。然后加入RNAP反应的其他成分,但不包括CTP。5min后,加入α-32P-CTP及IPTG,并设立不加IPTG对照。反应10min后,通过电泳观察是否发生run-off转录。
实验结果显示,确实观察到了转录题。因此,R不能抑制RNAP与laP之间的紧密结合。
实际上lac操纵子有3个operator。除了主要的O1,还有两个辅助的O,一个在上游,一个在下游,都与阻遏作用有关,但O1起主要作用。两个O之间可以通过R相互作用。
Lac操纵子的正调控
当E.coli在含葡萄糖和乳糖的混合碳源培养基中生长时,菌体首先利用葡萄糖,仅当葡萄糖消耗完后才利用乳糖。在葡萄糖存在时,即使无阻遏物存在(lacI-),lac基因也不表达。
进一步研究表明,葡萄糖对lac基因表达的抑制是间接的,是葡萄糖的某些代谢产物抑制了lac基因表达,因此这种效应被称为代谢物阻遏效应(catabolite repression)。
无论真核生物还是原核生物,cAMP对基因表达的控制都具有普遍作用。
1958年,E. Sutherland在研究动物激素作用的过程中发现了cAMP,可以激活糖原磷酸化酶(1971年获nobel奖),cAMP由腺苷酸环化酶产生。ATP在腺苷酸环化酶的作用下产生cAMP和PPi。一些激素,如肾上腺素,可以激活腺苷酸环化酶。研究发现这个分子在体内有各种不同的功能。
Monod&Jacob有句格言(aphorism) "what is true for Escherichia coli is true for the elephant"。一些生化学家开始用细菌系统来阐明cAMP的功能。Mackman&Sutherland发现在葡萄糖饥饿的E.coli细胞内cAMP含量上升。加入葡萄糖后cAMP含量下降。
后来Ira Pastan等证明加入cAMP可以解除代谢物阻遏效应(包括lac、gal、ara操纵子)。那么cAMP是正调控因子吗?
(注:Pastan 1961年在NIH和Jim Field一起研究甲状腺刺激激素(TSH)的功能。在Earl Stadtman实验室做了一段博士后,然后又转向研究TSH。当时Earl Sutherland已发现很多激素可以激活腺苷酸环化酶,从而增加胞内cAMP水平。这也启发Pastan研究起甲状腺中的cAMP水平的变化。他发现TSH也能激活腺苷酸环化酶,使组织内cAMP水平增加;而且,在组织内加入cAMP的类似物也能产生TSH的许多作用。指出cAMP是TSH作用的中介。那么cAMP是怎样起作用的呢?他想也许通过对E. coli的研究更容易找到答案。他和Robert Perlman就开始一起研究。受Sutherland工作的启发,做了上述实验。)
Geoffrey Zubay和Pastan两个小组几乎同时发现与cAMP结合的蛋白。Zubay称为catabolite activator protein (CAP),Pastan称为cAMP receptor protein(CRP),其编码基因名称为crp。Pastan还测定了cAMP-CAP的解离常数,为1-2´10-6M。
CAP作用机制
Zubay等发现一系列突变株,CAP和cAMP均不能促进其lac基因转录。突变位点在lac启动子内,后来分子生物学家确定了cap的结合位点就在lac启动子的上游(Activatorsite)。Pastan等人证明CAP-cAMP与A位点结合后,可帮助RNAP形成开放性启动子复合物。(P188 Fig7.10)首先将RNAP和lac启动子结合,加或不加CAP-cAMP。然后同时加入核苷酸和利福平。看是否已形成开放性复合物。如果没有,利福平就会抑制转录的进行。如果已形成开放性复合物,利福平则不能抑制转录进行。结果,加入CAP-cAMP转录可以进行,不加则转录不能进行。
CAP-cAMP可使DNA弯曲,或与RNAP发生作用,或者两者皆有,使RNAP与启动子形成一个开放性启动子复合物。(证据:CAP-cAMP可与RNAP共沉淀;CAP-DNA晶体结构显示DNA发生弯曲。)