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主题：【分享】PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌

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发表于：2011/05/17 08:59:05 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
一、实验目的

        掌握PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌具体方法及操作步骤。

        二、实验原理

      聚合酶链反应(polymerase chain reaction )简称PCR，是一种体外酶促合成反应，扩增特定DNA片断的方法。该技术于1985年由美国的KaryMullis等人首创并由美国GETUS公司开发。其原理是：在存在DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液(Mg2+)的反应体系中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片断进行扩增。这种扩增是通过模板DNA、引物之间的变性、退火(复性)、延伸等三步反应为一个周期，循环进行，使目标DNA片段得以扩增。由于每一周期产生的DNA片断均能成为下一次循环的模板，故PCR产物以指数形式增加，从而实现信号的放大。

        本实验以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶为靶基因进行检测。

        三、实验材料

        1．菌种：Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)－26003-21

        2．乳制品：全脂乳、脱脂乳和奶酪均购自当地超市。

        3．培养基：营养肉汤培养基

        4．化学试剂：10xPCR buffer、dNTPs、TaKaRa Taq、DNA Marker DL2000，

        5．引物： 正向引物：GCGATTGATGGTGATACGGTT                   

        反向引物：AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC

        6．实验仪器：PCR仪、DXY-33A型电泳仪、UVIpro凝胶成像系统

        四、实验步骤

        1.将已人工污染的乳品25ml接入225ml营养肉汤培养基中，37℃振荡培养过夜

        2.取1ml培养液于1.5ml离心管中，11000rpm，离心1分钟，弃去上清液

        3.用灭菌的纯水洗涤菌体沉淀两次，再用100ul灭菌纯水溶解沉淀物

        4.将菌悬液于沸水浴中煮沸10分钟，11000rpm，离心1分钟，取上清液，备用

        5.PCR反应体系：总反应体系50ul。包括5ul 10XPCR buffer ，4ul dNTPs混合物，0.5ul 40umol正向引物，0.5ul40umol反向引物，0.25ul（5U/ul）Taq酶，模板2ul，水37.75ul。

        6.PCR扩增程序：PCR反应采用冷启动。94℃预变性4分钟，再按94℃1分钟－52℃0.5分钟－72℃1.5分钟进行35个循环，最后72℃延伸3.5分钟。

        7.电泳检测：取5ul PCR产物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，利用凝胶成像系统观察结果并成像。
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无机麦地
shuiyang88
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2011/5/31 23:51:09 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
乳品中金黄色葡萄球菌容易生长么？
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