反相色谱具有分离效率高、应用范围广、性能稳定等特点，是HPLC中应用最为广泛的分离模式，但是由于氨基酸带电荷，在反相色谱柱上保留弱。用离子对试剂虽然能够在一定程度上增加保留，但是选择性差异小，分离比较困难；同时氨基酸的检测也是难点。目前最为常用的氨基酸分析方法是在分离之前使氨基酸与带疏水性基团的衍生试剂反应生成利于在反相柱上保留、分离的化合物，经柱分离后，通过相应的检测器定性、定量。

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2011/5/23 9:37:59 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 省部重点实验室(gl19860312) 发表:
迪马科技AAA柱子使用经验（一）

迪马科技AAA柱子使用经验（一）

待续....................

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2011/7/26 9:46:20 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

建立一种快速，高效，节省测定氨基酸的反相高效液相色谱柱前衍生方法。用C18氨基酸专用柱，苯异硫氰酸（PITC）作为柱前衍生的衍生试剂。梯度洗脱程序，流速1.0ml/min,柱温40℃，波长254nm为条件。40分钟内准确完成对18种氨基酸的测定。

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2011/7/26 9:47:16 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

衍生方法

1分别取液1.2ml和液13.9ml用乙腈定容到100ml

2 取200µL的标样或样品于离心管中分别加入2.2.1配置好的衍生试剂，各100µL，室温静置放置1小时。

3 在衍生好的样品中加入试剂正已烷400µL，震荡后静置10min取下层清液10µL注入色谱仪。

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2011/7/28 10:11:18 Last edit by gl19860312

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2011/7/26 9:47:36 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

色谱条件

色谱柱：氨基酸分析专用ODS柱；柱温：40℃；流速：1mL/min；波长：254nm。

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2011/7/26 9:49:20 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

氨基酸与衍生物在ODS 固定相上的保留强弱与分离效率不仅与ODS 固定相表面C₁₈官能团的键合量、键合所用单体的性质、键合反应催化剂、溶剂等条件有关，同时与固定相所用硅胶微球的宏观和微观性质如粒度分布、平均孔径及孔径分布、孔容、比表面积、金属杂质含量等因素有关。

由于流动相为含盐溶液的有机溶剂，溶剂长期存留在色谱柱中会导致固定相的破坏，建议用户在当天分析工作结束之后用5％的乙腈水溶液洗色谱柱20~30min；然后再用纯乙腈洗色谱柱20~30min才能关机，最终纯乙腈溶剂冲洗色谱柱后储存。建议冲洗色谱柱的每一种流动相体积不小于20mL。

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2011/7/27 15:12:33 6楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

样品成分如果太复杂的话最好经过一些处理

侧氨基酸的处理程序，我不清楚

但是测有机酸的处理程序如下：

样品预处理
（1）取1ml发酵液10,000r/min离心5min；
（2）取上清0.5ml,加入0.3gNaCL, 0.10ml 2.3mol/L H2SO4, 2.50ml乙醚，在振荡器上混合1min，5,000r/min 离心3min；
（3）取乙醚相1.00ml,加0.20ml0.1mol/LNaOH混合1min，5,000r/min离心3min,吸去上层乙醚，用试纸测试pH>9（在酸性条件下，用乙醚萃取，将有机酸以分子形式萃取到乙醚相中，再在pH>9的条件下反萃取到水相中，可大大去除其他物质的干扰），开盖挥发乙醚相后，置干燥器内干燥；
（4）加入2.5ml 0.02mol/LKH2PO4 （pH2.2）溶解，10,000r/min离心10min；
（5）取1.5ml0.45µm膜过滤注入样品瓶，取10μl进样分析。

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2011/7/27 15:15:37 Last edit by gl19860312