主题：【在线讲座76期】化学发光分析法简介，火热进行中……（即日至6月19日结束）

【在线讲座76期】 化学发光分析法简介

主讲人：CE-CL老师
 
活动时间：2011年6月8日——2011年6月19日

写在前面的几点说明：
1、楼主只是一个从事了几年科研工作的小人物，应zhou版主之邀（承蒙版主看得起），结合自己以前写的一些文字，来发这篇帖子，涉及的只是化学发光分析法的皮毛。由于知识积累和知识水平都非常有限，错漏之处肯定很多，请大家批评指正。
2、本帖的主要参考文献为林金明老师的专著《化学发光基础理论与应用》（化学工业出版社（北京），2004）。林老师还有一本专著，关于化学发光免疫分析的。有兴趣的朋友可以看看这两本书，进行深入的学习。

1 基本原理
化学发光（Chemiluminescence，CL）是产生于化学反应过程中的一种光辐射。在化学发光反应中，受化学能的激发，反应体系中的某部分形成激发态，激发态分子回到基态时便产生一定波长的光。早在古希腊及罗马时代（公元前300年），人们就观察到了生物发光。19世纪后期，人们发现了简单有机化合物产生的化学发光。Wiedeman在研究了许多发光现象的基础上，于1888年首次用“化学发光”这一术语来描述由化学反应发射的光。
化学发光分析法是借助化学发光现象而建立起来的一种分析方法，此方法不需要复杂的仪器，不需要光源和色散装置，没有光学分析方法中常见的散射光和杂散光的干扰，因而具有简单快速、灵敏度高、线性范围宽的优点。广义的化学发光也包括电致化学发光（Electrogenerated chemiluminescence, ECL）。
化学发光反应一般可表示为：
A + B → C* + D    （1-1）

C* → C + hν          （1-2）   
这个过程包括化学激发（1-1）和化学发光（1-2）两个关键步骤。

一个化学反应要产生化学发光现象，必须满足以下条件：一是该反应必须提供足够的能量，并由某一步骤单独提供，因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫消失在溶液中而不能产生发光。若要在可见光范围观察到化学发光现象，要求化学反应提供的化学能在150～300 kJ · mol-1，许多氧化还原反应所提供的能量与此相当，因此大多数化学发光反应是氧化还原反应；二是要有有利的反应过程，使化学反应产生的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态；三是生成的激发态分子必须具有一定的化学发光量子产率，或者能够将其能量转移给另一个分子使之生成激发态并释放出光子。

2 定量依据
化学发光强度ICL取决于反应的速度dP/dt和化学发光量子效率ΦCL：

ICL(t) = ΦCL dP/dt    （1-3）

其中，ΦCL可表示为ΦrΦf，Φr为生成激发态产物分子的量子效率，Φf为激发态产物分子的发光量子效率。对于给定的化学发光反应，ΦCL为一定值，dP/dt可按质量作用定律表示成与反应体系中物质浓度的关系。原则上来讲，对任何化学发光反应，只要反应是一级或假一级反应，都可以通过式（1-1）进行化学发光定量分析。在上述化学发光反应中，如果物质B保持恒定，而物质A的浓度变化并可视为一级或假一级反应，则：

ICL = ICL(t) dt = ΦCL [d A(t)/dt] dt = ΦCL cA    （1-4）

即化学发光强度与A的浓度成正比。据此，通过测定发光强度就可以测定反应体系中某种物质的浓度。式（1-4）即为化学发光定量分析的基础。

3 化学发光试剂
化学发光试剂是化学发光分析的基础，开发和使用发光量子产率高的化学发光试剂，对提高化学发光分析的灵敏度和扩大其应用范围具有重要意义。目前比较常用的化学发光试剂大致可以分为以下四类：鲁米诺（Luminol）类、光泽精（Lucigenin）类、过氧草酸酯（Peroxalate）类、钌（Ⅱ）多吡啶配合物。
其中，大家最熟悉的应该就是鲁米诺了。鲁米诺的化学名称是5-氨基-2,3-二氢-1,4-二杂氮萘二酮，碱性条件下被过氧化氢氧化时发出蓝光，最大发光波长为425 nm。通常情况下，鲁米诺与过氧化氢的化学发光反应相当缓慢，但是，当某些催化剂，如过渡金属离子（Co2+、Cu2+、Fe3+等）、棕榈酸盐或者某些金属复合物（如氯高铁血红素、血红蛋白、过氧化酶）等存在时，反应速率大大提高。在一定范围内，化学发光强度与鲁米诺、过氧化氢或催化剂的浓度呈正比，相关反应已用于测定上述所有物质。
而楼主较为熟悉的是钌（Ⅱ）多吡啶配合物，这是一类无机化合物发光试剂，目前使用最多的是三(2,2’-联吡啶)钌(Ⅱ)（Ru(bipy)32+），其次是三(1,10-菲咯啉)钌(Ⅱ)（Ru(phen)32+）。这类试剂水溶性好、性质稳定、发光量子产率较高，且发光后不被破坏，具有很好的应用前景。近年还出现了有关锇（Ⅱ）的类似配合物的报道。
1966年，Hercules和Lytle首次公开报道了Ru(bipy)32+的化学发光现象。他们将Ru(bipy)32+溶于0.05 mol ·L-1的酸中配成毫摩尔级的溶液，用固体二氧化铅将其中的二价钌氧化成三价，得到的Ru(bipy)33+溶液经离心后移出。当Ru(bipy)33+与氢氧化钠（9 mol · L-1）或肼（0.1 mol · L-1）反应时，有很强的橙色化学发光产生。他们注意到，Ru(bipy)33+无论是与氢氧化钠还是与肼反应，所得到的化学发光光谱是相同的，其发射波长大约在600 nm左右，这与Ru(bipy)32+的磷光光谱极为接近。后来，有关反应机理的研究证明，[Ru(bipy)32+]* 明亮的橙色化学发光是由化学方法诱导而产生的磷光发射，这在简单溶液中是一个十分罕见的例子。
不同物质与Ru(bipy)32+（或Ru(phen)32+）的化学发光反应都包括以下三个步骤：第一，Ru(bipy)32+和参与化学发光反应的物质分别与氧化剂（例如固体PbO2或Ce(Ⅳ)溶液）作用或在电极上被氧化，生成Ru(bipy)33+和某种强还原性的自由基中间体；第二，Ru(bipy)33+与强还原性的自由基中间体作用，得到发光物质[Ru(bipy)32+]*；第三，[Ru(bipy)32+]*回到基态，将激发态的能量以光辐射的形式释放出来。上述步骤中所说的“参与化学发光反应的物质”通常是体系中的待测物质，Ru(bipy)32+的发光强度与其浓度有关。

4 化学发光联用技术
基于自己的实验经验，楼主认为：化学发光分析法最主要的缺点是选择性差，应用于复杂样品的分析还有一定的困难。与分离技术联用，有可能解决这个问题。自20世纪90年代以来，毛细管电泳-化学发光联用技术（CE-CL）的研究吸引了很多科研人员的注意，得到了较快的发展。早期的研究工作绝大多数集中于仪器装置的构建，其核心是CE分离与CL检测接口的优化。在这些研究工作的基础之上，现已报道了大量的CE-CL检测方法，这些方法可以用于复杂样品中药物、酚类、胺类、有机酸、生物碱、氨基酸、金属离子等的测定。