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主题：【分享】化学分析样品制备（续之前的86讲）

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第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（71）

2．42  SPE 吸着剂的选择

2.4.2 吸着剂的选择

    大家都知道分析物的结构是选择适合样品制备吸着剂的向导，图101-1是选择SPE吸着剂的指南，不同类型的分析物应选用什么吸着剂。许多SPE生产厂家都提供类似的指南性图表，为了使用这种图表，分析人员必须要回答下列问题：

*          你要处理的样品基体主要是和水或是与有机溶剂混溶？

*          如果样品能溶于水，样品是离子型的，还是非离子型的？

*        如果是离子型的，一直是离子（于溶液pH无关），还是可离子化的（受溶液pH影响）？分析物是阴离子还是阳离子？

l*          如果分析物不能离子化或离子化要受到溶液pH的影响（离子化被pH所抑制或形成离子对），分析物是非极性（疏水性）、中等极性或计性（亲水性）？

*        如果样品可以和有机溶剂混溶，它是和非极性溶剂混溶，如己烷，或是也和极性溶剂混溶，如甲醇。

*          分析物是非极性的（疏水性），中等极性或计性的，或是极性的（亲水性）？

                   



SPE使用不同类型的吸着剂可以按照吸着剂和分析物主要的相互作用机制分成若干组合，见表2-6。反相键合硅胶吸着剂是把十八烷基（C18）、辛基（C8）、乙基（C2）键合到硅胶上，或者是环己基（CH）、苯基键合到硅胶上，或者是由聚合物树脂构成如苯乙烯-二乙烯基苯。这类吸着剂主要通过范德华力与分析物作用。非离子型水溶性化合物可以被反相吸着

                表 2-6 SPE 吸着剂-分析物相互作用机制



剂保留，但是分析无如果能溶解在甲醇或甲醇-水混合物中，则不被保留。正相极性吸着剂，如硅胶、氧化铝和佛罗里土以及氰基键合相，吸着剂与分析物的计性基团以偶极-偶极作用力进行作用。氨基(NH2)和二醇基吸着剂以氢键方式保留分析物。己烷溶解的分析物可以很好地被正相吸着剂保留，如硅胶或佛罗里土，或者具有极性基团的键合相，例如氨基或二醇基。强阳离子交换剂（SCX)和强阴离子交换剂(SAX)吸着剂主要通过静电力保留分析物。石墨化碳黒吸着剂具有一般范德华力和阴离子交换剂或静电力来和分析物作用进行保留。
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第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（72）

2.4.3. 回收率

      回收率是使用添加已知组分样品到样品基质中进行测定计算而得到，即从吸着剂洗脱下来的量与原有含量进行比较。SPE有两个不同的阶段，即保留和洗脱，但是测定出来的回收率是这两个阶段的总和，它决定于吸着和洗脱的效率，所以开发出来的方法的回收率是一笔糊涂账，它决定于吸着和解吸的过程：

        回收率=吸着效率×解吸效率

      如果吸着效率是50%，解吸是100%，那么回收率就是50%，而且不可能知道到底是吸着效率低，还是解吸效率低，或者可能是二者都低。所以开发方法既需要优化吸着又要控制解吸，反之亦然。或者，使用统计因子设计来确定，快速优化变量对选择SPE来说是很重要的。无论使用什么方法，抓住最重要的影响保留的因素是十分重要的，包括pH，样品体积，和吸着剂的质量。

1．样品pH 对吸着的影响

      如果样品是可以电离的，萃取过程就要受到pH的影响，图2.35是用图表来表示pH对SPE回收率的影响，图 102-1中是表示用苯乙烯-二乙烯基苯非极性固定相的SPE小柱对邻苯二甲酸单酯溶液pH对回收率的影响。




邻苯二甲酸单酯是弱酸性,由于在分子中有羰基,在pH 2时,SPE的回收率从76%(邻苯二甲酸正甲基单酯)到99%(邻苯二甲酸正辛基单酯),而对邻苯二甲酸正戊基单酯是100%.当pH值增加时,在pH 3 和 5之间,回收率急剧下降。从这些数据得到结论：邻苯二甲酸单酯的pKa在3到5之间，这一同系物每个成员的pKa很近似，羧酸基的电子特性不受碳链长度的影响，在pH 2时这些化合物不会离解，而在pH 6时这些化合物突然变成离子状态，回收率从10%（邻苯二甲酸正甲基单酯）到79%（邻苯二甲酸正辛基单酯）。
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第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（73）

2.4.3. 回收率

样品体积对回收率的影响

      穿透体积是可使用最大的样品体积，这样可以得到的100% 回收率，但是这一数值很难预计或从试验得到（就像股市上的最高点），可以使用Poole 和 Poole的定义,这一定义武断地把穿透体积作为1% 浓度样品进入吸着剂床，并在吸着剂出口处可以检测到的体积。

      吸着剂的类型和数量、分析物的疏水性和电离度、样品体积及pH交互决定穿透体积的大小。对特殊质量的吸着剂，其穿透体积可以用加载恒定浓度样品的不同体积，或不同浓度、不同体积的样品进行测试，后一种方法包括加载恒定摩尔数的样品，不管用那种方法，总是有一个可以预估穿透体积的方法。



atsias 发表了吸着决定于样品体积的结果（图2-36)，他们是用SPE-HPLC在线测定酚和胺的衍生物，使用不同聚合物SPE测定这些化合物品体积对回收率的影响，在这里只列出使用使用苯乙烯-二乙烯基苯聚合物SPE分析苯胺、苯酚、4-硝基苯胺和4-硝基苯酚的数据，试验水溶液的体积为5, 10, 25, 50, 75, 100, 125,和150 mL，在进性萃取以前把溶液调节成pH 3。4-硝基苯胺和4-硝基苯酚样品在10 和 25 mL之间从吸着剂透过时回收率开始下降，苯胺、苯酚的透过体积在这一情况下小于5 mL。

    母体化合物苯胺、苯酚和它们的衍生物4-硝基苯胺和4-硝基苯酚之间回收率受加样体积的影响程度不同，这是由于分析物的疏水性不同，以及分析物在不同pH溶液中的酸电离常数的不同所带来的影响。



Log PX——取代基的疏水性

Log PH——母体化合物的疏水性

π——取代参数

    如果π是正值表示疏水性比原来的氢更强一些，如果π是负值表示亲水性比原来的氢更强一些。从表中的数据可以看出，苯酚和苯胺的硝基取代参数参数为正值，所以它们的回收率要高于苯酚和苯胺。
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第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（74）

2.4.3. 回收率

3  吸着剂量对回收率的影响

        在到达漏出体积(见下图2.37）之前，增加吸着剂的量会提高样品的体积量，他们的相互关系如图2.38所示，用两个串联的C8 SPE柱从50-mL 样品体积（72 ppb) 测定回收率，每个SPE柱含有1.0g 吸着剂，选择邻苯二甲酸二酯做分析物，包括邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二正丁甲酯（DNBP）、邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP）、邻苯二甲酸二2-乙基己酯（BEHP）和邻苯二甲酸二正辛酯（DNOP）。




等样品加载完之后，把这两个萃取柱分开，分别用10 mL 己烷进行洗脱，分别计算每个萃取柱的回收率，图 2-37 横坐标从左到右化合物的疏水性依次增加，结果说明1.0 g 量的 C8吸着剂（上下叠加的两个SPE柱的上柱）一个柱就可以把BEHP 和 DNOP全部保留，但是对DMP、DEP、 DNBP和 BBP就不能全部保留，后面这些化合物的疏水性比前面的低一些，所以它们的漏出体积要小一些，测定出来的DMP 和 DEP在下面的SPE柱中的回收率大约为16%左右。DNBP 和 BBP在下面的SPE柱中的回收率大约为2%。BEHP 和 DNOP全部保留在上面的SPE柱中。BEHP 和 DNOP的疏水性很高，所以它们的漏出体积要大一些。BEHP 和DNOP需要比较少两的吸着剂就可以达到回收率较高的要求。对DMP, DEP, DNBP和 BBP来说与吸着剂的范德华作用力比较弱，所以需要较多的吸着剂，对BEHP 和DNOP与吸着剂的范德华作用力比较强，所以需要较少量的吸着剂，对所有的化合物要得到优化的回收率需要2.0 g 的 C8 吸着剂。



分析物在吸着剂上的保留与样品体积和吸着剂量之间存在依赖的关系，如图 2-38所示。对给定量的吸着剂，分析与之作用力小漏出体积就小，对任何样品其体积在漏出体积之内，分析无就可以和吸着剂很好地作用，分析物与吸着剂作用力强就需要叫少量的吸着剂达到定量分析的回收率的要求。
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第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（75）

2.4.3. 回收率

4  洗脱溶剂强度对解吸的影响（1）

    溶剂的相对洗脱强度（或洗脱剂强度），用极性图来描述溶剂的洗脱强度（图2.39）。在极性、正相SPE（如硅胶或氧化铝）上一个溶剂的相对洗脱强度，与其在非极性、反相SPE上的次序是相反的。


按照这一图表，水在反相溶剂中是最弱的溶剂，而己烷是最强的溶剂，溶剂极性降低时洗脱能力提高。互相混溶的混合溶剂可得到中等洗脱强度的溶剂。当选择解吸溶剂时，要考虑溶剂对样品基体和污染物回收率的影响，如果有可能，要筛选、控制洗脱样品基体和污染物的主要溶剂，考虑使用什么溶剂能够使要测定的样品得到最高的回收率，而让样品中的污染物尽可能少地洗脱出来。

Suzuki et al. [1]在使用苯乙烯-二乙烯基苯聚合物SPE柱处理邻苯二甲酸酯时，筛选了三种溶剂——二氯甲烷、乙醚和苯，找到最佳的洗脱效果，如图2.40。

溶剂洗脱强度对邻苯二甲酸单甲酯（MMP）、邻苯二甲酸单乙酯（MEP）、---邻苯二甲酸单正丙酯（MPRP）、邻苯二甲酸单正丁酯（MBP）、邻苯二甲酸单正丁酯（MBP）、邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP）、邻苯二甲酸单戊酯（MPEP）和邻苯二甲酸单辛酯（MO
P）。


图 2-40 洗脱溶剂解吸强度对回收率的影响

[1] Suzuki et al，Environ. Sci. Technol. 2001, 35: 3757 3763
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第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（76）

2.4.3. 回收率

4  洗脱溶剂强度对解吸的影响（2）

                  分析物的疏水性对回收率的影响

      解吸溶剂对邻苯二甲酸单甲酯回收率的影响，随着溶剂碳数的增加其疏水性粗略的有上升趋势，当使用苯作解吸溶剂时，分析物的回收率由于分析物的疏水性增加而提高，从邻苯二甲酸单甲酯的24%到邻苯二甲酸单辛酯的37%。

    尽管希望苯是非极性聚合物吸着剂的强洗脱溶剂，但是在这一个例子中并非如此，这是由于苯的非极性使其在这种吸着/吸附型吸着剂有水的情况下，不能湿润吸着剂所致，吸着剂吸附的水难以完全去除，即使在真空干燥之后也不易去除，而且在这种情况下使用苯作洗脱剂使回收率的数据也不正常。在使用己烷作洗脱剂时也有这种情况。使用二氯甲烷或乙醚作洗脱剂邻苯二甲酸单酯的回收率除去邻苯二甲酸单甲酯以外为86%，如图 2-40所示。与苯相比二氯甲烷或乙醚增加了对非极性吸着剂（表面上吸附有水）的湿润性，使用二氯甲烷或乙醚作洗脱剂使邻苯二甲酸单甲酯回收率的降低，其原因可能是由于吸着不完全所致（即超过了漏过体积，而不是由于洗脱不完全，因为疏水性越强，度附回更完全。

                      洗脱溶剂体积对脱附的影响

      使用SPE开始样品的体积(Vi )除以最后或洗脱溶剂体积(Vf )表示希望得到回收率为100%的浓缩程度（举例来说一个优化的方法处理一个1000-mL的样品，用10-mL溶剂洗脱，希望的到100倍的浓缩，所以使用最少量的溶剂得到有效的回收率用于产生最大的样品浓缩程度。但是脱附样品使用较大量低洗脱强度的溶剂就不如使用较少量洗脱强度大的溶剂，因为溶剂量大就会给吸着剂带来可能多的污染物。

      使用1.0 g C8 SPE 从50-mL样品中萃取25 ppb的分析物，萃取邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二正丁酯（DNBP）、邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（BEHP）、和邻苯二甲酸二辛酯（DNOP），见图2-41。溶剂用量对洗脱，即回收率的影响。在这一分析中己烷洗脱剂从5 mL 增加到 10 mL，所有的分析物的回收率都有所提高，在图中按洗脱剂的体积和分析物的疏水性的提高进行排列，疏水性最小DMP 和 DEP使用1.0 g  C8吸着剂没有完全被保留，在所有的分析物中BEHP 和DNOP的疏水性最强，所以使用5 mL洗脱剂就可以比较完全地洗脱下来。



[1] Suzuki et al，Environ. Sci. Technol. 2001, 35: 3757 3763
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第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（77）

2.4.4  操作方法

一般上讲，SPE包括四个步骤，见图 2-42


一般讲，SPE进样样品处理包括四个步骤：①小柱制备，或预冲洗；②上样（保留或洗着；③小柱后冲洗；④样品脱附（洗脱或解吸）。虽然现代的吸着剂技术可以不要柱字的制备，但是小柱的预冲洗有时还是需要的，以便使固定相活化。选择小柱的后冲洗是为了出去不需要的污染物。有时要分离的分析物当干扰物冲洗之后是保留在小柱上的，通过洗脱把分析物洗下来。

例如反相填料SPE的操作程序：

一.  老化

    1.  用3-5ml甲醇冲洗填料

    2.  用3-5ml水或缓冲液冲洗，上样前勿让填料流干。

二. 上样

    样品加到柱床上，以1-5ml/min.低流速通过填料。

    若所需样品不会被保留，此时应收集样品作分析。

三. 冲洗

      如果样品被保留，使用约5ml极性溶剂(如水、缓冲液或有机溶剂/水混合液)将弱保留干扰物洗出。

四. 洗脱

    用1-2ml 非极性溶剂将所需物质洗脱，收集用于分析。
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第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（78）

2.4.4  操作方法

SPE的操作步骤和SPE与HPLC操作模式的比较

      SPE不是一个单一的色谱过程，SPE是一个非平衡的方法，并具有非线性色谱的模式的特点（表 2-43）：加载样品或者保留阶段，包括前延分色谱和样品脱附或洗脱，包括分步洗脱，或者程序脱附，或者置换展开。与SPE相反HPLC是线性色谱方式，或者线性洗脱色谱，这样一来会导致分析物的稀释，而SPE是使分析物浓缩的过程。在HPLC中样品的进入是洗脱展开（图 2-44a）




在图中混合物是以很小的量注入到色谱柱顶部，在流动相的连续冲洗下各个组分在固定相上分离开。在SPE中，样品的加入就像在前延分析中（图 2-44b），连续把样品加到柱中，使少量分析物得到纯品。线性色谱和非线性色谱的不同在于样品加到吸着剂中的方法不同，所以SPE的结果是纯化以后的浓度高于原来样品的浓度，而HPLC在洗脱中使分析物浓度低于原来样品中的浓度。

SPE小柱和HPLC柱的比较



柱管

不锈钢

塑料


颗粒度

3～5微米

30- 40 微米


颗粒形状

球形

无定形


理论塔板数/柱

2～2.5万

< 100


洗脱方式

连续

开关式洗脱


操作成本

高

低


设备成本

高

低


分离模式

多种

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第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（79）

2.4.4  商品SPE

SPE 吸着剂有两种商品形式（见图 2-45）：

1．  SPE小柱子，像注射器的针筒

2．  吸着剂盘



SPE盘的类型

•        在PTFE或玻璃纤维中填充一层吸附剂

•          0.5mm× 47mm（或90mm）

•          5-10μm厚度的吸附剂

•          可以使用多种吸附剂,如 C8、C18、DVB、阴离子、阳离子、碳、鳌合物、放射性核素

SPE盘的特点：

•    在SPE过滤盘中使用的颗粒大小通常为5-10微米

•    小颗粒意味着非常高的动力学特性

•    较好的动力学特性意味着对化合物的保留与流速无关

•        47、50和90mm直径可选

•        多种厚度可选（通常为0.5mm）

•        多种填料：C8，C18，阴离子,阳离子，螯合物，含碳物

•        多种流动特性

液-液萃取和SPE 盘的比较

液-液萃取                          SPE 盘

•        使用200-500ml溶剂          使用20-30ml溶剂

•        摇动/连续过程              过滤过程

•        产生乳化现象/表面活性剂    不会产生乳化现象

•        选择范围窄                  选择范围 宽（吸附剂）

•        处理效率：2小时/样品        处理效率：20分钟/样品
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第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（80）

2.4.4  操作方法

多阶段SPE（1）

      基本的SPE操作包括四个步骤，如前所述，但是使用多阶段SPE程序，例如选择性吸收、选择性吸附、和多模式处理，比如色谱模式的按次序分离（见图110-1，前面提到过），这样一来可以增加SPE的选择性。



SPE柱的柱效比HPLC要小两个数量级，但是SPE柱的容量可以满足化学级别的分离，可以用于多组分样品的选择性分离要分离的化合物。多阶段SPE方法开拓利用分析物各种作用力，如疏水性、极性和无机物性能，多阶段SPE可以进行多次萃取或分离，提高分离效果。SPE的选择性吸着能够以控制样品基体或吸着剂来实现，选择性脱附可以用不同的洗脱剂强度、离子强度、pH、或者洗脱溶剂体积进行多阶段顺序洗脱来实现，色谱模式的顺序(CMS)方法是连续使用不同的色谱吸着剂进行SPE操作。

    下面是一个多阶段SPE的例子[1]。

Wells等人使用多阶段SPE程序，即不同的洗脱剂从反相SPE小柱上分别净化和洗脱毒莠定和2,4-D，这是由于毒莠定和疏水性不同（见图110-2）



图 110-2  用多阶段SPE程序分析毒莠定和好，4-D

文献

[1] M. J. M. Wells，J. L. Michael,Anal.Chem.,1987,59(13):1739～1742
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