3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备
3.1物品及试剂:接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球
3.2培养基
改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.
液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.
营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮.
3.3操作步骤:
a.打开洁净工作台。
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线,用手轻轻将安瓿掰开(开启安瓿时必须小心,因为安瓿遇热时可能会破裂)。
d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5~0.8 ml到安瓿中。
e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。
f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。
g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度(细菌培养温度30~35℃,培养18~24小时;真菌培养温度23~28℃,培养3~5天。观察是否浑浊,浑浊说明菌种复苏生长;若不浑浊,细菌应延长培养时间至7天,真菌应延长培养时间至14天,若仍未浑浊,灭菌处理。
h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1~2滴滴在改良马丁琼脂斜面上,用吸管涂布均匀,置23~28℃培养5~7天,斜面正面为黑褐色厚绒状,色泽均一,不应有杂色,斜面侧面无色,接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有0.05%(ml/ml)的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。
i.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀,1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备10支,按顺序进行编号,最后一支做为质控管进行质量控制,即进行相应的确认。其余作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮,制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、30%的无菌甘油混匀,1-2ml/管封存于冻存管。制备10支,按顺序进行编号,最后一支做为质控管进行质量控制,即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括:菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。
j.储备菌种管制备成功,储存于-20℃,有效期为三年。