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主题：【转帖】【方法经验】简明BrdU荧光标记（IHC和ICC）

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发表于：2011/10/13 18:51:48 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

最近在此经常看到有战友了解和咨询BrdU标记染色方法，我这里根据个人经验稍微整理一下protocol如下：

*在进行之前，请确保所有试剂的准确。！！！浓度及PH值！！！

免疫细胞化学

细胞培养数小时后，加入BrdU 数小时后进行BrdU染色。
染色方法如下：

1）4% 多聚甲醛室温固定20-30分钟；
2）PBS洗涤10分钟/次，3次；
3）2N HCl，室温， 15分钟；
4）PBS洗涤10分钟/次，3次
5）等量于2N HCl （体积相等）0.1M NaB4O3 室温15分钟；
6）PBS洗干净（适当延长时间和加大体积，完全洗净）；
7）0.1%Triton X 1-2min；
8）10%血清中封闭45-60min
9）一抗稀释于10%血清中4度过夜；
10）PBS洗涤10min/次，3次；
11）二抗稀释于PBS 室温一小时
12）PBS洗涤3次
13）Hochest染核。
免疫组织化学（适用于200-300微米的活脑片）

1）4% 多聚甲醛室温固定20-30min；
3）PBS洗涤20-30min/次，3次；
4）2N HCl 室温1小时；
5）PBS洗涤20-30min/次，3次；
6）0.1MNaB4O3 （等量于2N HCl，体积）室温1小时；
7）PBS洗干净；
8）4度block液过夜；
（block液：PBS+10%BSA+0.3%Triton-X100（+0.2‰NaN3，防腐，有毒，可不加））
9）一抗稀释于block液中4度过夜（适用于脑片，普通10-20微米切片按正常IHC步骤即可）；
10）PBS洗涤30min/次，3次；
11）二抗稀释于Block液中过夜；
12）PBS洗涤30min/次，3次；
13）Hochest染核并用共聚焦显微镜拍摄统计。
-------------------------------------------------------

该帖子作者被版主 zhang8826857加 3积分， 2经验，加分理由：感谢分享

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2011/10/13 18:52:06 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

EdU操作步骤：

1）4% 多聚甲醛室温固定20-30分钟；
2）PBS洗涤；

3）EdU染料染色；

4）PBS清洗；

5）Hoechst染核。

无需变性，无需抗原修复，无需抗体抗原反应，无需过夜。

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2011/10/13 18:54:07 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

EdU染料和传统的BrdU标记进行免疫荧光是不同的。EdU染料，既然称之为染料，自然无需其他一抗二抗之类的反应。而BrdU掺入只是核苷酸分子，本身不带任何发光基团，必须靠DNA变形后，暴露BrdU的抗原才能被一抗识别。这是和EdU染料不同的地方。

EdU介绍：

EdU（5-Ethynyl-2’- deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo?荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。
与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU与T非常相似，而EdU染料只有BrdU抗体的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等），可有效避免样品损伤，而且无需抗原抗体反应，能在细胞和组织水平更准确地反映DNA复制活性。

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