主题：绿原酸、黄酮提取求助

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绿原酸（chlorogenic acid）是一种从双子叶植物（如忍冬叶、咖啡豆、向日葵）的叶和果实分离得到的酚类,也是许多中草药（如杜仲、金银花、茵陈等）及中药复方制剂抗菌消炎、清热解毒的主要活性成分，目前已成为中草药制剂质量控制的主要指标之一。
绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。它是一种由咖啡酸(caffeic acid)与奎尼酸(鸡纳酸,quinic acid,即1-羟基六氢没食子酸)缩合而成的缩酚酸,异名咖啡鞣酸,化学名3-O-咖啡酰奎尼酸(3-O-caffeoylquinic acid),分子式为C16H18O9,分子量:345.30，半水合物为针状晶体，<?xml:namespace prefix = st1 ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:smarttags" />110℃时变为无水化合物，易溶于水、乙醇、丙酮，微溶于乙酸乙酯，常温下呈淡黄色固体。
绿原酸在植物中分布广泛,从高等双子叶植物到蕨类植物均有报道，但含量较高的植物不多，主要存在于忍冬科忍冬属(Lonicera)、菊科蒿属(Artemisia)植物中，其中包括杜仲、金银花、向日葵、咖啡、可可树。植物的不同品种、发育阶段、同一植株的不同部位、存放时间、生长环境等均能影响植物中绿原酸的含量。
以杜仲为例：叶中绿原酸的含量高于皮中含量数倍之多；用不同干燥方法对绿原酸含量的影响研究中,用阴干、晒干、直接烘干所测绿原酸含量分别是2 .21%、2. 17%和2 .24%;鲜叶绿色含绿原酸3 52%,放置1年后,叶色棕绿,绿原酸含量为2 47%。
由于绿原酸是极性较强的有机酸，易溶于醇、水，难溶于氯仿、乙醚,因此绿原酸的提取方法较多，有醇（甲醇、乙醇）溶法、水提醇沉、醇提铅沉、石灰乳沉淀法及聚酰胺柱层析法等。下面介绍几种提取方法。醇溶法：先用氯仿进行连续提取至流出液呈无色;再改用95%工业乙醇提取,提尽绿原酸;将所得乙醇提取液减压浓缩成浸膏,与干净细沙拌合后,用热水提取数次,使绿原酸转溶于水中,弃去残渣;所得水溶液用乙醚萃取,进一步除去脂溶性杂质;向脱脂后的水溶液中加入饱和无机盐溶液,至沉淀完全,并稍有过量为止。此时,水中的绿原酸与金属离子结合生成不溶性盐;用离心分离法分离出沉淀并除去沉淀中的金属离子后,将所得滤液用有机溶剂萃取数次,回收溶剂,得绿原酸粗品,经分步结晶和重结晶等方法精制,即得绿原酸纯品,得率约为0.5%。水提醇沉法：采用水为溶剂,加热煮沸提取,但相应地增加其他水溶性成分如蛋白质、多糖、鞣质等杂质,可用传统的醇沉法除去。醇沉过程中伴随吸附和包夹,致使绿原酸有不同程度的损失。提取水提液中绿原酸时,分次醇沉比一次醇沉所得产品纯度高;当乙醇浓度最终为90%时,一次醇沉的损失率比分次醇沉较大。水提石灰乳沉淀法：在待测物水溶液中,加石灰乳使绿原酸生成钙盐沉淀,用稀酸分解,提取物中绿原酸得率较低,可能因为绿原酸是酯类,被强碱水解所致。虽然许多研究者对绿原酸含量的测定方法进行了研究或评述,在分析、测定过程中不乏采用层析方法,但各种方法均有其不完善之处，难以分离出全部绿原酸并得到纯品（不包括绿原酸异构体）。

同样，绿原酸的含量测定方法有许多种。由于许多物质同绿原酸分子结构相似,同存于一种药材或制剂中。因此在进行含量测定时常难以分离。常用分析方法有紫外分光光度法(UV)、高效液相色谱(HPLC)法等。这些方法要么难以完全分离待测物质，要么易受干扰，或者分析时间长、效率低。现在在中药成分分析中开始采用一种新技术即高效毛细管电泳(HPCE) 技术。它具有高分离效率、分析时间短、进样量少、低检测限和重现性好等特点。但由于在中药材的成分分析中才刚应用，效果如何还有待评价。下面介绍一种检测方法。1. 标准曲线的绘制精密称取绿原酸标准品80mg，用95%乙醇溶解，转移到250ml容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混匀。精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0ml到250ml容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混匀，此为标准系列溶液。在330nm处测定吸光度，以绿原酸标准品的浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并求出相应的回归方程。2    . 样品中绿原酸含量的测定（1）提取液的制备  准确称取中草药提取物样品各1.0835g，置于250ml锥形瓶中，量取约50ml95%的乙醇溶解样品，并置于85℃的恒温水浴箱中，回流4h。放置、冷却至室温，过滤，然后加95%的乙醇将提取液定容于250ml容量瓶，待用。（2）含量测定  准确吸取样品提取液5ml于25ml容量瓶中，加95%的乙醇稀释到刻度，得到待测样品液。以95%的乙醇作空白，在330nm处测定吸光度，由标准曲线计算出待测样品液浓度。3      . 回收率的测定准确称取中草药提取物样品0.20g，分别加入一定量的绿原酸标准品，按上述操作方法进行，用紫外分光光度法测定吸光度，得出绿原酸含量，根据回收率公式计算出回收率，重复6次。用紫外分光光度法测定绿原酸含量，相对标准偏差较小，结果重现性好，精密度高。

杜仲叶含量测定方法（绿原酸）
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    杜仲叶为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥叶。2005版《中国药典》采用高效液相色谱法，以绿原酸为对照。绿原酸的含量测定方法文献报道较多，本网站在石韦、山银花等含量测定方法中对相关药材及制剂以作了介绍，这里简要介绍杜仲叶及其制剂的含量测定方法。
    2005版《中国药典》杜仲叶含量测定项下：
    色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.04%磷酸溶液（13：87）为流动相；检测波长为327nm。理论板数按绿原酸峰计算不低于2000。
    供试品溶液的制备：取本品粉末（过三号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
    文献报道的HPLC方法，除了采用药典方法外，还有其它实验条件。如：谢敏等测定杜仲叶及其提取物中绿原酸的含量，采用岛津LC-10Avp 泵；SPD-10Avp 紫外检测器；大连Elite Hypersil C18 (4.6mm×200mm，5μm) 色谱柱；浙江大学N2000 通道色谱工作站；流动相:甲醇-20.5%醋酸(12：88)；流速1.0mL/min；检测波长327nm；柱温35℃。药材以乙醇为提取溶剂。彭密军用高效液相色谱法测定杜仲叶中绿原酸的含量。采用岛津高效液相色谱仪LC-9A , SPD -6A 紫外可见检测器；检测波长326nm；色谱柱为YWG-C18 (10μm，150×6mmid)不锈钢柱；流速1ml/ min；走纸速度SPEED-1mm/ min；衰减3；柱温25℃；流动相为：乙腈-水-乙酸=10：88：2。绿原酸的提取：将阴干的杜仲叶放入提取罐中, 加入适量的去离子水, 在室温下采用超声波预处理后, 用SZTC天然沉降剂代替醇沉工艺, 以除去蛋白质、鞣质、树脂、果酸等大分子物质；然后再利用超滤膜分离技术处理提取液(这时固溶物绿原酸含量可达10%左)；最后采用有机溶剂分离纯化, 减压回收溶剂, 干燥后得样品。
    文献报道的纸层析-紫外分光光度法：
    钱骅等采用纸层析-紫外分光光度法，对不同采收期、不同性别、不同干燥方法及不同贮藏时间杜仲叶绿原酸含量的动态变化进行了研究。测定波长为326 nm；回归方程为C = -0.7844 +1813361A，r=0.9999。样品处理方法：准确称取10g杜仲叶，粉碎，用70 %乙醇提取3次，减压浓缩至一定体积，上D101柱，水洗，15 %乙醇洗至绿原酸全部洗出，合并水和15 %乙醇洗脱液、浓缩、定容(样品液体积)。细条状点样,以正丁醇-冰醋酸-水(4：1：5) 混合后的上层液作展开剂。杜仲叶绿原酸含量%=(18.3361A – 0.7844) ×稀释倍数×样品液体积(ml) 〕/ 样品叶克数×106×100%。
    吴红等采用纸层析-紫外分光光度法及薄层色谱扫描法分别测定杜仲叶中绿原酸含量。
    纸层析-紫外分光光度法：正丁醇-醋酸-水(4：1：5) 混合液上层液作展开剂。测定波长为324nm。薄层扫描法：展开剂: 正丁醇-乙酸-水(4：1：1)；显色剂：三氯化铁-铁氰化钾试剂(1g/L )；以680nm为测定波长，450nm为参比波长；狭缝宽1.25mm×1.25mm；线性化SX = 3 ,作反射法锯齿扫描。薄层扫描法操作简便、省样、省时,不失为测定氯原酸含量的较理想方法。纸层析-紫外分光光度法因其纸层析分离清晰,变异系数相对较小,测定值较准确. 综合考虑，纸层析-紫外分光光度法是测定杜仲叶中氯原酸含量时可采用的较优方法。
    张凤云等通过不同的提取方法和分离方法, 对杜仲叶中绿原酸含量的测定结果进行了比较。认为在常规实验室中, 用乙醇提取-纸层析分离-紫外分光光度法测定杜仲叶、杜仲皮或杜仲产品中绿原酸含量的方法简便易行, 结果可靠。

我是在标准品和层析树脂没有到的情况下先摸索的，我分别用微波、超声波提取，并且比较了甲醇、乙醇水溶液的提取，用提取液点样薄层层析，在紫外分析仪上出现了荧光，但发现不同的展开剂得到的点不一样，将提取液uv波长扫描，发现在215，330有最大吸收波长，有可能是绿原酸吗？你说我如果有c18柱，我有必要再纯化，分离吗？直接侧可以吗？

我做过金银花中的绿原酸含量测定,用50%甲醇超声即可,方法简单.我做过对比,50%甲醇的提取率明显好与甲醇,只是不容易过滤.