主题：【分享】美国76人因饮用生奶感染弯曲杆菌

出口食品中弯曲杆菌检验方法　　　　　　　SN 0175-92
代替ZB X09 011-88
Method for detection of campylobacter
species in food for export
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1　主题内容与适用范围
　　本标准规定了出口食品中弯曲杆菌的检验方法。
　　本标准适用于出口畜肉、禽肉、水产品和牛奶中弯曲杆菌检验。其他出口食品可参
照使用。
2　设备和材料
2.1　微需氧培养设备：最佳微需氧条件为5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气。可用具双
相压力计的厌氧罐、蜡烛缸、气袋或其他可代用的装置。
2.2　天平：称量2000g,感量0.1g。
2.3　均质器。
2.4　离心机：带50mL离心管。
2.5　显微镜：相差或暗视野。
2.6　培养箱：25,37和42℃。
2.7　水浴箱：37℃。
2.8　注射器：20mL。
2.9　针头过滤器：滤膜孔隙为0.65μm。
2.10 三角烧瓶：50,250和500mL。
2.11 平皿：90或100mm。
2.12　吸管：1和5mL。
2.13 试管：16mm×125mm,带螺旋帽。
3　培养基和试剂
3.1　弯曲杆菌增菌肉汤：根据用途,加入1号或2号抗生素溶液制成(A1)。
3.2　弯曲杆菌分离琼脂(改良Skirrow氏培养基) (A2)。
3.3　含0.18%琼脂的半固体布氏肉汤(A3)。
3.4　布氏琼脂(A4)。
3.5　营养肉汤(A5)。
3.6　中性红溶液(A6)。
3.7　3%过氧化氢溶液。
3.8　氧化酶试验试剂(A7)。
3.9　亚硝酸盐检测(硝酸盐还原) 试剂(A8)。
3.10 乙酸铅纸条：将滤纸条浸入饱和乙酸铅溶液中,然后取出,使其干燥。
3.11 硝酸钾。
3.12 甘氨酸。
3.13 氯化钠。
3.14 盐酸半胱氨酸(cysteine-HCl)。
3.15 马尿酸钠(sodium hippurate)。
3.16 萘啶酮酸(nalidixic acid): 每个圆纸片含30μg。
3.17 头孢菌新素(又称先锋霉素Ⅰ,cephalothin): 每个圆纸片含30μg。
3.18 茚三酮(ninhydrin)。
3.19 丙酮。
3.20 丁醇。
4　增菌
4.1　碎牛肉
　　使用加有按1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。称取25g样品,置于均质杯内,加
入100mL增菌肉汤,用均质器以8000～10000r/min均质30s。将均质液通过灭菌纱布,倒入
一个容量为250mL的三角烧瓶,置微需氧条件下,42℃培养24～48h。
4.2　净膛全禽和分割禽肉
　　在一个灭菌容器中,用250mL 灭菌营养肉汤振摇洗涤样品5min。取肉汤,经灭菌纱布
过滤,于23000×g、4℃离心20min,或于16300×g、4℃离心30min,弃去上清液,将沉淀
物混悬放在250mL三角烧瓶中的100mL加有按1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤中。
培养方法同4.1条。
4.3　牛奶
　　使用加有按1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。称取约40g牛奶放入离心管中,
按4.2条中的方法离心。弃去脂肪和上清液,将沉淀物混悬放在250mL三角烧瓶内的100mL,
增菌肉汤中,培养方法同4.1条。
4.4　贝类
　　使用加有按2号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。将100g样品和100mL增菌肉汤放
入均质杯中,用均质器以8000～10000r/min转速均质30s。用灭菌纱布将均质液过滤。取
50mL滤液放在500mL三角烧瓶内的200mL增菌肉汤中,培养方法同4.1条。
4.5　其他食品
　　所使用的增菌方法决定于食品的种类。虾、整只海鱼和海鱼片经表面洗涤法 (4.2
条)处理后,用加有按2号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤增菌。羊肉和猪肉块可先用
表面洗涤法处理,再用加有按1号配方配制的抗生素的肉汤增菌。碎肉按4.1条所列方法
处理。液体食品按4.3条所列方法处理。各种样品的培养方法均同4.1条。

5　分离和初步鉴定
　　取5mL经24～48 h增菌的培养物,以0.65μm孔径滤膜过滤。取经过滤和未经过滤的
增菌培养物,分别在分离用琼脂平板上划线接种,各不少于两个平板。将平皿置微需氧条
件下42℃培养24～48h。检查平板上有无透明-白色-棕黄色(可能出现浅红色)凸起、边
缘不整齐、有时沿接种线向外扩散的菌落。挑取典型菌落制作湿片,用相差(或暗视野)
显微镜检查,本菌呈现快速的螺旋样运动。涂片作革兰氏染色镜检时,本菌为革兰氏阴性,
如小逗点状,两菌体的末端相接时,呈S形、海鸥展翅形或螺旋状。挑取初步鉴定为弯典
杆菌菌落,在布氏琼脂上划线作纯分离。培养方法同上。根据生化、生长特性和抗生素
敏感性试验进行菌株证实。
6　证实
6.1　生化试验
从用作纯分离的平板挑选2个典型菌落。从每个典型菌落各挑取一满接种环,分别接
种于放在50mL三角烧杯中的4mL布氏肉汤中,置微需氧条件下42℃培养24～28 h。同时接
种一份已知阳性培养物,以在整个证实试验中作为对照。在大多数情况下,用于生长试验
和生化反应的基础培养基是含0.18%琼脂的布氏肉汤。这种培养基分装在16mm×125mm
试管中,每管7mL。从所有布氏肉汤中取出各接种物,滴加0.2～0.3mL于琼脂表面。
6.1.1　生长温度试验
　　接种3管含0.002%中性红(NR)的基础培养基,其中一管置37℃培养,检查在这一温度
下的生长情况,并用于观察过氧化氢酶反应。另两管分别置42℃和25℃培养。每日检查
有无生长。对未生长者需培养5d,方可作出最后判断。弯曲杆菌的生长应只限于接近培
养基表面的一薄层,广泛的生长不是由于弯曲杆菌属细菌所致。
6.1.2　过氧化氢酶试验
　　滴加3%过氧化氢溶液于显示有细菌生长的试管内,出现气泡者为阳性反应。
6.1.3　氧化酶试验
　　使用琼脂平板表面经24h培养的生长物(也可取用于抗生素试验的平板),将氧化酶试
剂滴于棉拭子上,并用棉拭子去接触表面生长物。在接触点出现深蓝色斑点者为阳性。
6.1.4　硝酸盐还原试验
　　将供试培养物接种于含1%硝酸钾的基础培养基。置空气中于37℃培养5d。加入亚硝
酸盐检测试剂甲液和乙液(A8),出现红色者表明硝酸盐还原成亚硝酸盐,为阳性反应。
6.1.5　1%甘氨酸中生长试验
　　将供试培养物接种于加有NR和1%甘氨酸的基础培养基。置空气中于37℃培养。每日
检查有无生长,对未生长者需培养5 d,方可作出最后判断。
6.1.6　3.5%氯化钠中生长试验
　　将供试培养物接种于加有NR和3.5%氯化钠的基础培养基。置空气中于37℃培养。每
日检查有无生长,对未生长者需培养5 d,方可作出最后判断。
6.1.7　硫化氢产生试验
　　将肉汤培养物接种于加有0.02%盐酸半胱氨酸的基础培养基,将一根浸有饱和乙酸铅
的滤纸条悬于试管的上部(不让滤纸条接触培养基),旋紧试管帽。置空气中于37℃培养。
每日检查,观察滤纸条是否变黑,纸条变黑表明有硫化氢产生,为阳性反应。对未出现阳
性反应者需培养5 d,方可作出最后判断。
6.1.8　马尿酸盐水解试验
　马尿酸盐水解培养基即1%灭菌马尿酸钠溶液,可用试管分装,每管0.4mL,冻存备用。
用2mm接种环取一满环在琼脂平板上培养过夜的生长物,接种1%马尿酸钠溶液中,振摇试
管以分散培养物,置37℃水浴中放置2h。在每个试管中加入0.5mL茚三酮试剂 [将3.5g茚
三酮溶于100mL 1:1丙酮和丁醇的混合物中],将试管于室温下放置2 h。出现紫色者为阳
性反应。
6.2　抗生素敏感性试验
　　用灭菌棉拭子将预先准备的布氏肉汤培养物涂布于布氏琼脂平板。将含头孢菌新素
(30μg)和萘啶酮酸(30μg)的圆纸片分别贴于平板表面。置微需氧条件下于37℃培养24h,
检查有无抑菌圈。
6.3　根据下表对细菌作出鉴定

弯曲杆菌的特性鉴别
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┃ 弯 曲 杆 菌
试验项目 ┣━━━━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━
┃胎儿弯曲杆菌胎儿亚种┃空肠弯曲杆菌┃结肠弯曲杆菌┃NARTC**1)
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过氧化氢酶 ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋
氧化酶 ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃　 ＋
硝酸盐还原 ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃　 ＋
半胱氨酸形成H2S ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃　 ＋
1%甘氨酸中生长 ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃　 ＋
3.5%氯化钠中生长┃ － ┃ － ┃ － ┃　 －
37℃生长 ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃　 ＋
25℃生长 ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃　 －
42℃生长 ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃　 ＋
马尿酸盐水解 ┃ － ┃ ＋ ┃ － ┃　 －
萘啶酮酸试验 ┃ R**2) ┃ S**2) ┃ S ┃　 R
头孢菌新素试验 ┃ S ┃ R ┃ R ┃ R
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注：1) NARTC为抗萘啶酮酸嗜温弯曲杆菌。
　　 2) R为耐受; S为敏感。

有3种弯曲菌对人有致病作用胎儿弯曲菌能典型地引起成人菌血症常发生于同时伴有好发性疾病如糖尿病肝硬化或恶性肿瘤的病人这些细菌也可引起复发性感染若患者的免疫球蛋白有缺陷则这种复发性感染很难治疗空肠弯曲菌可引起婴儿的脑膜炎空肠弯曲菌和结肠弯曲菌可引起任何年龄人群的腹泻弯曲菌是普遍能分离获得的细菌性病原菌感染的腹泻病人中>90%可分离获得空肠弯曲菌与野生的或家养的感染动物接触摄入被污染的食品（特别是未烧熟的禽类食品）和水可引起暴发流行但散发病例的传染源常不清楚夏季空肠弯曲菌性腹泻的暴发流行与其后发生的（可达30%的病例）Guillain-Barré综合征之间存在相关性


最常见的表现为肠炎与沙门菌病及志贺菌病相似肠炎可发生于各年龄人群但1~5岁为发病高峰年龄腹泻为水泻有时呈血性粪便涂片经染色后可见白细胞虽然腹痛和肝肿大也很常见但复发后或间歇发作的发热（体温38~40℃）是全身性弯曲菌感染唯一始终有的症状这种感染还可表现为亚急性细菌性心内膜炎脓毒性关节炎脑膜炎或无痛性不明原因发热（FUO）

必须作微生物学检查才能作出诊断特别需要与溃疡性结肠炎鉴别应用标准培养基可从血液和各种体液中分离出弯曲杆菌但若从粪便标本中分离则需用选择性培养基：应用7%溶解的马血清琼脂加万古霉素多粘菌素B和甲氧苄氨嘧啶（TMP）的Skirrow培养基

为啥要喝生牛奶呢？还是煮熟了比较好喝

之前听说生牛奶有营养一些

吃法吃出来的问题。。。