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主题：【分享】填料对色谱行为的影响

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发表于：2012/03/09 20:35:18 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1、粒径

一般认为，基质的颗粒形状和大小，主要影响流体动力学行为，影响分离效率。填料的粒径决定了填充液相色谱柱的柱效。从VanDeemter方程可知，在优化的流动相线速度下，最佳理论塔板高度为：

H _min=2.48 d_p

根据这一公式，可以计算出不同力度填料填装的柱子可获得的最大理论塔板数。例如，3um粒子可获得13.4万理论塔板/米，5um粒子可获得8万理论塔板/米。但是，小粒子填料容易造成柱压高、易堵塞、寿命较短。为保证一定的流动相线速度就得提高输液压力，虽然，大多数高效液相色谱仪的压力上限可允许达到42Mpa,但因长时间工作在高压状态下肯定会缩短输液泵及进样阀的使用寿命。为此，小粒径的柱子一般较短。

2、填料形状

现在，10um以下的分析型柱多使用球形填料，而制备型的柱子则多选用无定形填料，因为无定形填料较为便宜且大粒度填料的粒间孔较大，所填装的柱子并不需太高的压力便能很好的运行。

3、孔径及孔径分布

填料粒子的孔径及孔径分布，主要从三个方面影响反相色谱的色谱行为。首先，是孔径影响了粒子必表面积的大小，从而对配基的数量，即碳含量造成影响，它涉及到样品的负载量。其次，孔径的大小，从空间上必然对溶质的分子量大小有所限制。此外，孔的不均一性，及孔径分布，也会带来尺寸排阻效应。

4、比表面积

填料的多孔性，极大地增加其比表面积。对于无孔的小球，其比表面积是很小的。但是一旦具多孔性，则多孔微球的比表面积为球外比表面积与孔内表面积之和。比表面积不同，其键合配基的量亦有所不同。所以，即使是以相同的反应条件制备的同样配基的反相填料，也会有不同的保留行为。特定溶质的保留值随比表面积的增大而减少。

5、基质硅胶的纯度

硅胶基质上残存的硅羟基和杂质金属离子，共同造成了以硅胶为基质的反相填料的“次级保留行为”。较多的杂质金属离子，会使具有螯合作用的样品被吸附在柱子上。在生物医药体系的分离、分析中，经常会遇到强极性的溶质，他们在制造不良的反相色谱柱中，经常会因强烈的非特异性吸附而难以获得良好分离。究其原因，除孔径大小的因素外，最大的可能是硅胶表面的覆盖率低和基质含金属离子太多所致。

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2012/3/10 13:20:53 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

现代高效液相色谱中，分离效果好坏的一个重要指标是色谱填料的选择。但是目前市场上有多种色谱填料可供选择，因此就必须对此有一定的认识和了解。

一、硅胶基质填料

1、正相色谱正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其他具有极性官能团，如胺基和氰基的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯甲烷等。

2、反向色谱反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合极性相对较弱的官能团。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填料有：C18、C8、C4等。

二、聚合物填料聚合物填料多为聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要优点是在PH值为1～14均可使用。相对于硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。

三、其它无机填料其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料。这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳黑的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合相硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳黑可用于分离某些几何异构体，由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可以用于HPLC。氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可以在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物的作用也很强，应用范围受到一定限制，所以未能广泛应用。新型色谱氧化锆基质填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用PH1-14，温度可达100℃。由于氧化锆填料是最近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行之中。

目前，商品化的色谱填料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3和5um填料。填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，柱压越大，柱压的增加限制了粒度小于3um的填料应用。在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是唯一的因素。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色谱柱的背压却是5um的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选用更短的色谱柱，即相同的塔板数或分离能力，但是柱长更短，以缩短分析时间。另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。

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