主题：【原创】提问帖（3.30）大家谈谈高速逆流色谱吧

（一）逆流色谱的概念

逆流色谱（Counter-current Chromatography）是一种不用固态支撑体或载体的液-液分配色谱技术，是一种能实现连续有效的分配分离的实用分离技术。也就是说在这类色谱系统中，固定相和流动相都是液态的，这两相的物质可以是互不相溶或很少相溶的有机相-水相体系，也可以是大分子聚合物（polymer）的双水相体系。由于没有应用固态载体，所以不会出现固态载体对样品和分离结果的不可逆吸附、干扰污染、失活变性等不良影响。而且，因为分离柱内没有固态载体的占空体积，容易做到较大的进样量。它一种在国际上被公认的有效的分离纯化与制备的技术手段，特别适合于天然产物和活性组分的分离纯化和制备工作。但是，它的固定相和流动相都是液态的，如何使两相与被分离样品之间形成有效的分配与传递关系？它的固定相是液体的，如何使之能在分离管柱内空间保持稳定的保留状态？它不是靠特定种类和型号的填充材料来保证分离过程的选择性，如何选择液态的对流溶剂体系来保证有效的分配分离结果？这些问题，都需要从特殊的作用原理，特殊的运动机制，特殊的实验方法来研究解决。

（二）逆流色谱的起源与发展

逆流色谱起源于最简单的液-液分配装置——实验室里常用的分液漏斗。把两个互不混溶的溶剂相置入分液漏斗中，投入要萃取分离的样品，经振摇和静置，样品溶质就按分配系数的特征在两溶剂相间实现分配。如果两种溶质分子在两相溶剂系统中的分配系数差异明显，那么，在分液漏斗里的一次萃取过程中就能分离开来。但是，实际遇到的问题往往是要分离性质极其相近的复杂混合物，这就需要进行多次萃取才能实现满意的分离。20世纪30年代初，Jantzen对工业上混合物分离单元首先使用逆流分配的术语，并发展了实验室规模的逆流分配装置。1941年，Martin 和Synge提出了一种级联链型萃取装置，开创了分配色谱技术 。1944年，Craig发明了非连续式的逆流分溶装置（Countercurrent Distribution，CCD），它适用于大量或小量的样品的液液分配分离。在分离大极性组分，包括天然产物、多肽和其他大分子时更具有特色，适合于大制备量的分离提取工作。CCD的主要缺点是：仪器设备庞大复杂容易破碎，溶剂系统容易乳化，溶剂消耗量大和分离操作时间太长等。此后，又出现过多种液-液分配分离装置和仪器，但都因没有根本的突破，因此，没有得到推广和应用。

1966年，日本学者Yoichiro Ito等首先在日本，随后在美国国立健康研究院（National Institute of Health, U.S.A）发现了一种有趣的现象，即互不混溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小孔径管子里会分段割据，并能在螺旋管转动的情况下实现两溶剂相之间的逆向对流。在内径约2毫米的螺旋管绕组层里，两相的分段状态能在重力场的作用下形成；而当螺旋管柱在一离心力场内转动时，特别是在如0.2毫米口径的细螺旋管柱里，会形成更强的两相分割趋势和对流趋势，这种分割和对流的过程是连续进行的。如果把要分离的样品从螺旋管柱的引入口注入，连续的分配传递过程就会在管柱里进行，从而实现连续的液液分配分离。在此基础上，Ito经过多年的潜心研究，已经在理论原理、仪器设计、实验方法和应用开发等方面积累了较为丰富的经验和成果，并设计制造了多种逆流色谱仪。特别是其单向流体动力学平衡理论的提出，导致了高速逆流色谱(High Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)技术的产生，并逐渐发展成了一个新型的分离科学分支。在HSCCC技术的基础上，先后又发展了多种HSCCC技术和仪器设备。如双向逆流色谱(Dual Countercurrent Chromatography，DuCCC)，正交轴逆流色谱(Cross-axis Coil Planet Centrifuge，X-axis CPC)，pH-区带精制逆流色谱(pH-zone-refining CCC)，离心沉淀色谱(Centrifugal Precipitation Chromatography，CPC)以及J型CPC上的螺线型圆盘柱组件系统等系列技术与仪器的出现，使HSCCC技术研究更上一个台阶，各个逆流色谱仪出现的时间见表1。同时，用HSCCC与质谱(MS)、傅立叶红外光谱( FTIR)或蒸发光散射( ELSD) 检测器联用，为HSCCC技术的应用提供了一种新型多维分离分析方法。CCC和HSCCC不仅对于中小分子天然产物的成分分离纯化具有特殊优势，而且对生物大分子乃至血细胞、组织细胞等粒子的分离能在此液液对流的环境条件下实现，它既保留了CCD法纯粹液液分配的特色，又具有现代色谱连续、自动、快速和高效的优点。在多个领域的应用工作得到快速发展，引起了世界各国的重视和关注。


（三）逆流色谱的研究与应用概况

目前国际上除了美国NIH，还有英国Brunel大学，瑞士Lausanne和Geneva大学, 法国Lyon大学等数十个国家及地区的著名研究机构和大学在从事逆流色谱技术的研究及在各个领域的应用工作。我国是国际上研究逆流色谱起步最早的国家之一。早在上世纪70年代末，张天佑教授领导的研究小组在国内最先自行研制了分析型和制备型的高速逆流色谱仪，并出版了相关专著，为我国逆流色谱的研究做出了开创性工作，并在天然产物领域的应用做出了特色性的工作。目前，国内已经有几十个单位开展逆流色谱的应用与研究工作。
高速逆流色谱用于天然药物化学成分的分离始于1985年，目前处于平稳发展阶段。自从2002年以来，我国学者发表的论文数量在总的论文数量中所占的比例最大，其次为美、日、德、法、英等。可以看到逆流色谱已经引起世界各国学者的注意，越来越多的研究者或应用者加入到逆流色谱的研究和应用的队伍中。特别是近十多年高速逆流色谱的发展，逆流色谱在生物工程、医药、生化、植化、农业、化工、环境、海洋科学、无机化学等广泛领域显现出越来越高的实用价值。

高速逆流色谱(high-speed countercurrent chromatography，简称HSCCC) 是一种较新型的液—液分配色谱,由美国国立健康研究院（National Institute of Health, U.S.A.）Ito博土最先研制开发，其原理是基于样品在旋转螺旋管内的互不混溶的两相溶剂间分配不同而获得分离，因而无须任何固体载体或支撑体，能达到在短时间内实现高效分离和制备，并且可以达到几千个理论塔板数。与其他柱色谱相比较，它克服了固定相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形施尾等缺点[3]。目前此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域[5]。我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家，俄罗斯、法国、英国、瑞士等国也都开展了此项研究。美国FDA及世界卫生组织（WHO）都引用此项技术作为抗生素成分的分离检定，90年代以来，高速逆流色谱被广泛地应用于天然药物成分的分离制备和分析检定中。本文对高速逆流色谱的原理特点及应用作一综述。
      2 高速逆流色谱仪及溶剂体系简介
      2.1 高速逆流色谱仪原理及特点
      HSCCC利用了一种特殊的流体动力学(单向流体动力学平衡)现象。具体表现为一根100多米长的螺旋空管，注入互不相溶的两相溶剂中的一相作为固定相，然后作行星运动；同时不断注入另一相（流动相），由于行星运动产生的离心力场使得固定相保留在螺旋管内，流动相则不断穿透固定相；这样两相溶剂在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配和传递。由于样品中各组分在两相中的分配比不同，因而能使样品中各组分得到分离。
      2.2 HSCCC的优点
      HSCCC主要具有以下几个方面的优点。
      2.2.1 应用范围广，适应性好。由于溶剂系统的组成与配比可以是无限多的，因而从理论上讲HSCCC适用于任何极性范围的样品的分离， 所以在分离天然化合物方面具有其独到之处。并因不需固体载体，而消除了气液色谱中由于使用载体而带来的吸附现象，特别适用于分离极性物质和其它具有生物活性的物质。
      2.2.2 操作简便，容易掌握。分离过程中对样品的前处理要求低，仅需一般的粗提物即可进行HSCCC的制备分离或分析。
      2.2.3 回收率高。由于没有固体载体，不存在吸附、降解和污染，理论上样品的回收率可达100％。在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。
      2.2.4 重现性好。如果样品不具有较强的表面活性作用，酸碱性也不强，那么多次进样，其分离过程稳定性都保持很好、峰的保留相对标准偏差也小于2%，重现性相当好。
      2.2.5 分离效率高，分离量较大。由于其与一般色谱的分离方式不同，能实现梯度操作和反相操作、亦能进行重复进样，使其特别适用于制备性分离，产品纯度高。研究结果表明:一台普通的高速逆流色谱仪一次进样可达几十毫升，一次可分离近10g的样品。因此，在80年代后期被广泛地应用于植物化学成分的分离制备研究。
      最初的高速逆流色谱仪只有一个分离柱，用配重平衡离心体系。最近的仪器在设计上有较大突破，采用多个分离柱，不用配重，性能和实用能力大大提高。目前高速逆流色谱仪有分析型和半制备、制备型三大系列，较大的制备型HSCCC，柱容积可达1000mL，一次最多进样可达20g粗品。不但适用于非极性化合物的分离，也适用于极性化合物的分离，对检测器的灵敏度要求不高。在制备分离方面，可用于天然产物中各组分的分离，也可进一步精制，甚至直接从粗提物一步纯化到纯品。
      2.3 溶剂体系的选择
      正确地选择溶剂体系是HSCCC分离成功的关键。通常所用的溶剂体系分为三类:亲水体系，由极性小的非水相与水相组成，两相极性相差很大；亲油体系，由高极性的非水相与水相组成，两相极性相差不大；还有一类处于两者之间，为中间体系。选择溶剂体系时遵循两个原则[6,9]：（1）溶剂体系的分层时间小于30S ；（2）目标样品的分配系数K接近于1，容量因子大于1.5。选择的方法有三种：参考前人体系、薄层色谱、高效液相。正己烷／乙酸乙酯／正丁醇／甲醇/水和氯仿／甲醇／水是比较经典的两个体系。对于未知样品混合物，推荐先采用正己烷／乙酸乙酯／甲醇/水(1∶1∶1∶1)或氯仿／甲醇/水(10∶3∶7)尝试，再根据目标组分的分配系数调整溶剂组成[9]。如可用乙醇代替甲醇增加体系的疏水性；加入盐(乙酸铵等)或酸(三氟乙酸或乙酸)增加体系亲水性。有文献报道：正丁醇／乙酸乙酯/水(3∶2∶5)适于分离极性大的物质，而正庚醇／乙酸乙酯／甲醇/水(6∶1∶6∶1)适于分离弱极性和非极性物质[10]。
      近年来，溶剂体系的选择范围越来越广泛。有人用超临界二氧化碳(SFCO2)作流动相[11]，利用SFCO2高扩散性、低粘度、流体特性、环境友好等优势[12]。还有人用制冷剂R134a(1，1，1，2—tetrafluoroethane)作流动相。由于B134a这种流动相在常温常压下是气体，不必再富集或蒸干溶剂收集，从而避免了纯品的损失。有人提出当准确了解两相组成后，可以独立配制上下两相，避免溶剂的浪费[15]。

4 高速逆流色谱的一些新进展
      4.1 与其他检测器的联用
      目前HSCCC多采用紫外检测器进行在线检测，但HSCCC选用的有机溶剂及所分离的组分，有很多不适合用紫外检测，因而大家把目光投向了各种检测器与HSCCC联用技术上来。分流器技术的使用，解决了HSCCC与各种检测器联用的接口问题，目前已有HSCCC与质谱（MS）、红外（FTIR）、蒸发光散射（ELSD）联用的应用，从而为HSCCC的应用提供了一种新型多维分离分析方法。Rinehart等报道了HSCCC与电喷雾质谱（ESIMS）联用技术[4]，并评价了色谱分离和质谱分析的表现，认为制备型逆流色谱更适合于天然产物的分离分析。
      近两年，国外有人成功的将HSCCC与ELSD联用，分离了7-甲氧基香豆素、橙皮素、莨菪亭、微形酮，效果非常好。深圳市同田生化技术有限公司应用HSCCC与ELSD联用，分流收集，成功的制备分离了银杏中四个内酯单体，并将之产业化。
      总之，各种检测器的优点与HSCCC技术的良好地结合，为逆流色谱技术的应用开创了一个广阔的局面。
      4.2双向逆流色谱
      双向逆流色谱[7]（dual-mode countercurrent chromatography,简称DuCCC），即两相分别从螺旋管两端同时流入，又从相对应的端口同时流出，两相形成真正的逆向对流。与常规的HSCCC相比，DuCCC分离速度更快，分离效率更高，不必预测溶质的保留时间和分配系数，减少了溶剂选择的繁琐。该项技术可应用在蛋白分离。
      4.3 利用HSCCC建立中药指纹图谱
      中药质量可控是中药现代化的一个重要内容，中药以及复方因其复杂的成分和未明的作用机理，阻碍着中药现代化的进程。中药指纹图谱技术已成为研究中药有效成分及作用机理，控制中药质量，推动中药业走向世界的关键技术。HSCCC具有很好的分辨率和重现性，加上不存在固体载体吸咐，对样品的前处理要求不高或不用前处理，不存在分离过程丢失成分和成分变性的问题，因而可用于中药有效成分的定性或半定量分析，并整理出中药材的特征峰和指纹谱，制定标准图谱，用于中药的质量控制和测定。在高速逆流色谱指纹图谱研究方面，目前已对大黄、沙棘、何首乌等一些中药进行了研究[10]。
      5 总结与展望
      逆流色谱无需固体载体，能实现连续有效分离，有多种多样的溶剂系统可采用；不但适用于非极性化合物，而且适用于极性化合物的分离；能实现从上百毫克量到数克的制备提纯；它可用于天然产物粗提物的去除杂质，也可用于最后产物的精制，甚至直接从粗提物进一步纯化到达纯品；也能与质谱仪或红外光谱仪、蒸发光散射仪等联用，应用前景十分广阔。随着HSCCC技术的迅猛发展，逆流色谱将在分离制备方面发挥越来越重要的作用。

哪个厂家在调整逆流色谱领域研究比较多?

楼上说了那么多，还是不太明白，为什么叫逆流色谱？这种色谱系统主要是用来做制备柱还是做分析？

原文由 木有才(xgy2005) 发表:
楼上说了那么多，还是不太明白，为什么叫逆流色谱？这种色谱系统主要是用来做制备柱还是做分析？

逆流色谱（Counter-current Chromatography）是一种不用固态支撑体或载体的液-液分配色谱技术，是一种能实现连续有效的分配分离的实用分离技术。

我也是第一次接触这个概念
原来真没听说过据说是国内研究的比较好的仪器之一

高速逆流色谱HSCCC仪器对于分离小分子药物所需要的含有机相两相溶剂体系有较高的固定相保留，而对于分离生物大分子所需要的聚合物双水相体系的保留能力较差，因此，研究和开发高效的分离生物大分子的HSCCC仪器和方法是近来人们研究关注的又一个热点问题.

原文由 yuduoling(yuduoling) 发表:
哪个厂家在调整逆流色谱领域研究比较多?

目前是上海张江药谷的一家公司，在高速逆流色谱仪领域是行业内的领军人物，已经有十几年的生产、研发经验，客户分布于国内外各大科研院校，应用范围遍布于天然产物化学、生物医药、食品科学、有机合成、环境分析等领域。