3、选择合适的固相萃取方法
固相萃取的保留机制可分为两种:
·吸附剂(填料)保留目标化合物:绝大多数化合物应用此机制,填料保留其目标组分及少量杂质,通过淋洗步骤去除吸附在柱上的少量杂质,最后选择合适的(洗脱)溶剂把目标组分洗脱下来。
根据吸附剂的保留机理可进一步分为:
(1)反相(C18,C8,CN,Phenyl,C4,C1)· 分析物:非极性至中等极性
· 基质:水溶性
· 方法:
a.活化:通常用水溶性有机溶剂如甲醇活化,然后用水平衡
b.淋洗:含0-50%极性溶剂的缓冲溶液淋洗杂质
c.洗脱:极性或非极性溶剂洗脱目标物
(2)正相(Silica, Florisil,Diol,NH2)·分析物:中等极性到强极性
· 基质:非极性至中等极性
· 方法:
a.活化:非极性有机溶剂b.洗脱:非极性有机溶剂如下图片:
(3)阳离子交换(SCX,PRS,COOH)u 分析物:阳离子(碱性)化合物
u 方法:
1.活化:用于非极性有机溶剂中的样品时,可用样品溶剂来活化;在用于极性溶剂中的样品时,可用水溶性有机溶剂过柱后,然后用水平衡,最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。
2.上样:样品溶液pH值要
小于其pKa两个单位(以保证其带电荷 )
3.洗脱:洗脱溶液pH值要
大于其pKa两个单位(中和分析物的电荷)
(4)阴离子交换(SAX,PSA,NH2,PAX/MAX )u 分析物:阴离子(酸性)化合物
u 方法:
1.活化:用于非极性有机溶剂中的样品时,可用样品溶剂来活化;在用于极性溶剂中的样品时,可用水溶性有机溶剂活化后,然后用水平衡,最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。
2.上样:样品溶液pH值要
大于其pKa两个单位(以保证其带电荷 )。
3.洗脱:洗脱溶液pH值要
小于其pKa两个单位(中和分析物的电荷)。
u 吸附剂(填料)保留杂质:
食品中色素等杂质的去除多用此机制。填料保留杂质而不保留或只保留极少量的目标组分,所以上样后即开始收集目标组分,最后用目标物所在的溶剂进一步洗脱。合并两部分收集液。
(1)活化:以样品所在的有机溶剂进化活化,1-2柱管体积
(2)上样:提取液转移至柱内,并收集流出液
(3)洗脱:用样品所在的有机溶剂进一步洗脱,收集流出液。合并上样和洗脱流出液。
4、固相萃取方法的优化
1)影响萃取效率的因素
(1)填料(固定相)----- 核心选择合适的SPE柱是保证理想结果的前提。
(2)洗脱溶剂的强度:Ø 采用正相固定相时,溶剂强度随其极性增强而增加;
Ø 采用反相固定相时,溶剂强度随极性减弱而增强。
(3)pH值: 离子交换固定相、被分析物和干扰物质的pKa各不相同。通过调节pH大小,可以使固定相带电荷,被分析物带相反电荷,而使干扰物质不带电荷;或者反过来,使固定相带电荷,干扰物质带相反电荷,而使被分析物不带电荷。
(4)操作:控制合适的流速、活化的时不要让柱干涸等
2)常见问题及解决方法·分析物回收率低
·萃取重现性差
·洗脱馏分中含有干扰物
·SPE柱流速降低或阻塞
具体解决方案如下:
A.
分析物回收率低• 未保留?
• 被淋洗?
• 未被洗脱或部分洗脱?
首先要把上样液、淋洗液、洗脱液均收集,进样分析,确定问题来源
回收率差如下图片 :
重现性差如下图片:
相关图片如下 :
相关图片如下:
举例说明1. 参考文献方法用C18柱做相关药物的净化,过柱方法如下:分别用乙酸乙酯、甲醇和水活化小柱,然后把处理过的样品过柱(溶剂为具一定pH值得缓冲溶液),水淋洗小柱后,用乙酸乙酯洗脱目标物。结果:接受液混浊状,回收率和重现性都不理想,可能是什么原因呢?答案:正确的做法是要在淋洗过程结束后把小柱完全抽干。原因有二,其一因为淋洗溶剂(水)与洗脱溶剂(乙酸乙酯)不互溶,如果不抽干洗脱溶剂与目标物不能充分作用,所以造成回收率和重现性都没有保证,同时从外观上看 接受液是液混浊液;其二如果淋洗过程不抽干小柱,洗脱溶剂里会引入水(淋洗剂),对下一步浓缩造成很大的困难。相关图片如下:
2、水中的灭草松前处理方法
取500ml水样过滤,待过Cleanert PEP柱(相当于Waters HLB)净化
1) 用5mL四氢呋喃洗柱子,除掉杂质
2) 用5mL甲醇1mL/min活化柱子
3) 用5mL纯水1mL/min活化柱
4) 500mL的水样以5mL/min的速度过柱
5) 5mL纯水2mL/min淋洗
6) 小柱真空抽干20min
7) 0.9mL的甲醇1mL/min淋洗,弃去淋洗液
8) 3mL四氢呋喃1mL/min的速度洗脱柱子,收集洗脱液浓缩定容至3mL
液相检测。
结果:回收率不理想,请问此方法有何问题?
答案:因为目标物灭草松呈酸性,pKa=3.3,而选择的小柱PEP是极性的。所以正确的做法是样品在过柱之前一定要调节水样的pH值小于等于3,使目标物分子化,以保证目标物能被小柱充分保留,否则在上柱的过程中容易造成“漏”的现象,从而造成回收率差。
三、固相技术应用实例解析
1、食品领域应用
1)动物组织中盐酸克仑特罗等4种β-激动剂药物残留检测(Cleanert PCX, P/N: CX1506)
1.实验材料1.1 固相萃取小柱:PCX(150mg/6mL)
1.2 四种β-激动剂药物:盐酸克仑特罗、沙丁胺醇、西马特罗、莱克多巴胺等4种β-激动剂药物。
2. 试样的制备取猪肝空白样品,经过液液萃取初步处理后,添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试样。
3. 净化 依次用甲醇5mL、水5mL和30mmol/L盐酸5mL润洗固相萃取小柱,将上述备用液过柱,依次用水5mL、甲醇5mL淋洗,真空抽干,用4%氨化甲醇5mL洗脱PCX小柱,收集洗脱液于具塞玻璃试管中,50℃下氮气吹干。在样液过柱和洗脱过程中流速控制在1mL/min左右。
4. 衍生化及检测将上述盛有残渣的具塞玻璃试管放入50℃烘箱中加热片刻,除去水分后,加入甲苯100mL和双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)100mL,涡旋振荡20s,密封玻璃塞,置于80℃恒温烘箱中加热1小时,冷却后加入300mL甲苯,作为试样溶液,供
气相色谱-质谱分析(色谱柱:DA-5MS, 30m×0.25mm×0.25µm,P/N:1525-3002)。
5. 结果5.1 回收率实验(精密度和准确度)
将猪肝空白样品经过液液萃取初步处理后,分别添加一定量的标准溶液,配制1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L和100μg/L五个浓度的试样溶液,每批次内同一浓度做5次平行实验,共4个批次(样品典型回收率色谱图见附图)。
猪肝中实验结果列表如下
添加浓度 (μg/L) | 回收浓度 (μg/L) | 平均回收值 (μg/L) | 平均回收率 (%) | 相对标准偏差 (%) |
1 | 0.75 | 0.72 | 72.40 | 5.93 |
0.67 |
0.72 |
0.70 |
0.78 |
2 | 1.62 | 1.63 | 81.30 | 1.23 |
1.66 |
1.60 |
1.61 |
1.64 |
5 | 4.02 | 4.24 | 84.80 | 4.16 |
4.10 |
4.27 |
4.38 |
4.43 |
10 | 8.24 | 8.45 | 84.45 | 2.81 |
8.35 |
8.77 |
8.62 |
8.25 |
100 | 90.24 | 9.12 | 91.15 | 2.86 |
87.15 |
91.77 |
92.62 |
93.95 |
5.2重复性实验(批间误差实验):
猪肝中实验结果列表如下
批间 | 添加浓度(μg/L) |
1 | 2 | 5 | 10 | 100 |
平均 回收率% | RSD% | 平均 回收率% | RSD% | 平均 回收率% | RSD% | 平均 回收率% | RSD% | 平均 回收率% | RSD% |
1 | 72.40 | 5.93 | 81.30 | 3.49 | 84.80 | 6.16 | 84.45 | 3.59 | 91.15 | 2.86 |
2 | 75.37 | 6.12 | 80.47 | 5.37 | 84.74 | 7.55 | 87.46 | 4.68 | 90.05 | 3.86 |
3 | 70.09 | 7.85 | 80.80 | 6.57 | 83.10 | 8.17 | 83.21 | 5.39 | 89.53 | 4.16 |
4 | 76.73 | 4.90 | 78.50 | 8.35 | 82.90 | 5.11 | 85.95 | 5.72 | 88.27 | 5.93 |
平均值 | 73.65 | 6.20 | 80.25 | 5.95 | 83.88 | 6.75 | 85.27 | 4.84 | 89.75 | 4.20 |
RSD% | 12.95 | 10.79 | 9.43 | 7.00 | 5.75 |
附图:猪肝中0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L和100μg/L六个浓度检测结果总离子流图(TIC)代表图谱:
猪肝+1ppb(PCX)
相关图片如下
2)鸡蛋中三聚氰胺的检测(Cleanert PCX, P/N: CX0603)
1 材料和方法
1.1 主要仪器和试剂,色谱柱(Venusil ASB C8,4.6*250mm,5μm,艾杰尔科技),混合型阳离子交换固相萃取柱(Cleanert PCX,60mg/3mL,艾杰尔科技),12位固相萃取装置(艾杰尔科技),高效
液相色谱仪;高速离心机;超声波震荡仪;涡旋混合器;分析天平(万分之一);溶剂过滤器(带0.45μm有机、水系过滤膜和真空泵);乙腈(HPLC级);三聚氰胺标准品(≥99.0%);柠檬酸(分析纯);庚烷磺酸钠(色谱级);水(二次蒸馏水以上)。
1.2 色谱条件:色谱柱:Venusil ASB C8,4.6*250mm,5μm;
流动相:乙腈∶10mM/L柠檬酸+10mM/L庚烷磺酸钠缓冲液=7∶93(pH=3.0)
检测波长:240nm;流速:1mL/min;进样20μL。
2 实验部分
2.1 三聚氰胺标准溶液配制:称取三聚氰胺标样10.0mg,加流动相溶解定容至100mL,即得浓度为100mg/L的三聚氰胺标样溶液。将浓度为100mg/L的三聚氰胺标准溶液分别用水稀释成浓度为1mg/L 、5mg/L 、10mg/L 、15mg/L 、20mg/L的标准品溶液,用0.45μm滤膜过滤后进
液相色谱检测。
2.2 1%三氯乙酸溶液溶液的配制称取三氯乙酸1.00g,加水溶解定容至1000mL即得。
2.3 5%氨化甲醇的配制准确量取5mL氨水和95mL甲醇,混匀后备用。
2.4 5%醋酸铅溶液的配制称取5.0g醋酸铅,加水溶解定容至100mL即得。
2.5 混合型阳离子交换固相萃取柱(Cleanert PCX 60mg/3mL)的活化取Cleanert PCX 固相萃取柱,以3mL甲醇,3mL水依次过柱活化,弃去流出液,备用。
2.5 加标样本处理将鸡蛋打开搅匀,分别称取1.00g鸡蛋样本置于10mL具塞离心管中,分别加入100mg/L三聚氰胺标样溶液10μl、20μl、100μl,分别得到添加浓度为1.0mg/kg、2.0mg/kg、10.0mg/kg的样本。
往装有上述样本的具塞离心管中分别加入10mL 1%三氯乙酸溶液,2mL 5%醋酸铅溶液,摇匀,超声20分钟,8000rpm离心10分钟,全部上清液转入活化好的混合型阳离子交换固相萃取柱(Cleanert PCX,60mg/3mL),依次使用3mL水,3mL甲醇淋洗,抽干,弃去淋洗液。最后用5mL 5%的氨化甲醇洗脱(V/V),接收洗脱液,50℃氮气吹干,用1mL流动相定容,0.45μm滤膜过滤后进
液相色谱检测。
另取空白鸡蛋样本1.00g,不添加三聚氰胺照上述方法处理,作为空白对照样品。
3实验结果:
3.1 峰型与分离度图片如下
由图1可见,用该方法处理,三聚氰胺峰型对称尖锐,且与杂质分离良好
3.2 精密度分别移取浓度为1.0mg/L、5.0mg/L的三聚氰胺标准溶液,分别连续进样6次,结果如表1所示。
表1 保留时间与峰面积的稳定性数据
浓度mg/mL | 指标 | 1# | 2# | 3# | 4# | 5# | 6# | 平均值 | RSD% |
1.0 | 保留时间(min) | 18.830 | 18.829 | 18.829 | 18.838 | 18.840 | 18.834 | 18.833 | 0.026 |
峰面积 | 89 | 81 | 84 | 88 | 84 | 80 | 84 | 4.286 |
5.0 | 保留时间(min) | 18.949 | 18.952 | 18.947 | 18.949 | 18.950 | 18.946 | 18.949 | 0.011 |
峰面积 | 423 | 440 | 438 | 439 | 437 | 438 | 436 | 1.461 |
由表1结果可见,本方法具有很好的精密度和重现性。
3.3 标准校正曲线表2 标准校正曲线实验数据
浓度 mg/kg | 峰面积 第1次进样 | 峰面积 第2次进样 | 峰面积 均值 |
1.0 | 89 | 79 | 84 |
5.0 | 423 | 440 | 431 |
10.0 | 832 | 844 | 838 |
15.0 | 1265 | 1299 | 1282 |
20.0 | 1689 | 1823 | 1756 |
根据以上数据计算线性方程为:y = 87.43x - 13.67, R² = 0.999 ,相关曲线见图2。
3.4 添加回收率
表3 添加浓度与回收率数据
添加浓度(mg/kg) | 峰面积 | 计算含量 | 回收率(%) |
1.0 | 19.9 | 1.158892 | 115.89 |
1.0 | 21.0 | 1.214532 | 121.45 |
2.0 | 41.7 | 2.261587 | 113.08 |
2.0 | 40.8 | 2.216062 | 110.80 |
10.0 | 188.8 | 9.702247 | 97.02 |
10.0 | 219.6 | 11.26018 | 112.60 |
由表3可见,本方法检测鸡蛋中三聚氰胺回收率较好。
4 结论通过上述实验可见,运用本方法测定鸡蛋中三聚氰胺,基质净化效果好,杂质干扰小,色谱峰型良好对称度高,操作简单方便,和准确度高等优点,非常适用于鸡蛋中三聚氰胺的检测。