主题：【讨论】省所关于2010班微生物专题班问题答案

药典培训班问题解答1：

1、十万级洁净区悬浮粒子数测试（≥0.5μm），采样量2.83L／次，如果用厂家为：Metone，型号227A的尘埃粒子计数器，打印出来的数据为30，请问这个数据可否转换为30X1000／2.83=10600.707粒／m3？

计算某一采样点是这样转换，但结果评定需同时考虑置信上限

2、悬浮粒子测定，假设操作规程为取样3次，求其平均值，那么这3次取样是否必须是连续的时间？比如：取样时间3min，取样3次，是否结果必须为10:03~10:06，10:06~10:09,10:09~10:12。

标准中未明确规定，但我所实际操作是连续取样，这样也方便操作

3、洁净度要求多少级别须测浮游菌？

100,000级以上需测，300,000级GMP和国标未给出允许数值

4、沉降菌测定过程中，每个房间部分分别取好几点，如果结果是每个地点报告还是所有点的菌落平均数报告，平均数是小于1cfu，这样报告数是报告小于1，还是真实的报告零点几cfu？新的GMP有没有特别的规定？

每个房间所有点的平均数，我所报告为真实数值，新GMP无特别规定

5、测沉降菌与浮游菌的培养基平皿，培养的时间是多少？

中国药典2010版细菌培养时间改为3天，但医药工业洁净室（区）未公布新标准，请先按现行培养时间2天，留意变化

6、请问沉降菌，浮游菌，纯化水，饮用水等菌落总数的测定培养时间需从48h改为培养3天？

纯化水请按中国药典2010版细菌培养时间改为3天，饮用水请按相关行业标准。医药工业洁净室（区）未公布新标准，沉降菌、浮游菌请先按现行培养时间2天，留意变化

7、请问：洁净度测试时采样管如何进行消毒？

采样管不吸附尘粒，无需消毒，可用酒精冲洗

暂无法解答的问题：

1、对于高效空气过滤器，尤其是洁净区中的超净台，测试通过率必须引入尘源，请问该如何引进？采用什么物质作为尘源？

无相关工作经验，请咨询洁净技术工程师

2、此外还有洁净区空气过滤系统，需要测试过滤效率，如何在中效与高效、初效与中效间引入尘源？主要担心引入的尘源会不会对洁净区或空气过滤系统造成不良影响

无相关工作经验，请咨询洁净技术工程师

3、在测量冷冻室温度时曾发现有温度计液柱断裂成数段的现象，请问有没有更有效的方法测量冷冻室的温度？

无相关经验

4、在抗生素生产车间中，为了消除抗生素的抑菌作用，在培养基平皿加酶，这酶有没有规定的量？如果要做这加酶培养基的灵敏度，那该怎么做？

无相关经验

5、新版GMP要求洁净度监测数据需要进行趋势分析，及测定控制限及纠偏限，请问应采用什么统计方法进行趋势分析及限度制订？

无相关经验

药典培训班问题解答2：

1、微 生物方法验证，要求菌株回收率≧70%，是否有上限要求？（如不得高于100%或者110%）。

答：没有上限。但一般不会高于100%，因为加进去的菌量是一样的，如果超过100%可看成是操作上的误差。按微生物的特性，如果不超过太多，是可以接受的，但没有具体上限。（本所控制在110%以内）。

2、在微生物方法验证时，霉菌、酵母菌计数验证只用黑曲霉及白色念珠菌做方法学验证，在操作培养过程中发现：在玫瑰红钠琼脂培养生长的白色念珠菌的形态太小与营养琼脂上培养的细菌的某些形态大小相同，这样如何判断营养琼脂上生长的菌落是否是白色念珠菌？为何这两种菌落形态相似？

答：菌落形态相似不等于就是同一种菌。在验证时，营养琼脂的验证菌株为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，如果本底菌为0，则营养琼脂上长的菌应该不是白色念珠菌。要判断是否为白色念珠菌，应进行白色念珠菌的相应鉴定方法后才能确定。任何微生物都不可能只是从菌落就可以进行判断，只能判断为疑似，然后再做一系列相应的鉴定实验后才能进行判断。

3、生孢梭菌的适宜计数用培养基？（很多验证需对生孢梭菌进行计数）

答：最简便的方法是用硫乙醇酸盐流体培养基。该培养基上层为含氧层，适宜需氧菌生长，下层为厌氧层（下层高度最好7cm以上），适宜厌氧菌生长。在培养16~18小时这个时间进行观察，计数，超过20小时,由于繁殖量大，培养基将混浊，点计不清。或者是用哥伦比亚琼脂培养基，浇注后，置厌氧罐（袋）里，再置培养箱培养，计数。

4、微生物限度检查法中所用的培养基要进行适用性检查试验，请问这些培养基还需要做无菌检查试验吗？

答：微生物限度检查，药典上没有特别说明对培养基作无菌性检查，但每次都要做阴性对照实验，阴性对照是检查整个检验系统是否被微生物污染，实际上也包括了培养基的无菌性检查。

5、微生物限度检查法中所用的培养基如：营养琼脂、EMB、Macl等培养基其分装容器需要预先灭菌吗？

答：不用。只要是洁净的就行，因为分装后还要灭菌。

6、具有抑菌性的供试品，细菌、霉菌、都是用薄膜过滤法来检查的，那么沙门菌可以用常规法来检查吗？就是可以不经过过滤直接接种到营养肉汤中吗？

答：这要看你验证的结果。如果通过验证，你的品种是对沙门菌有抑制作用，且用培养基稀释法不能消除其抑菌性，则就必需考虑用薄膜过滤法。

7、微生物限度检查中，稀释剂对照组，是在稀释液中加入50~100cfu的菌，还是把稀释液制成含量50~100cfu的浓度呢？

答：是把稀释液制成含50~100cfu/ml菌的浓度。（在这里，我对上次讲课时关于稀释剂对照组操作的PPT进行纠正，对于离心+薄膜过滤法的稀释剂对照组的操作应该是：含50~100cfu/ml菌的稀释液    离心    取稀释液（与试验组同样取上层液）    过滤、冲洗    贴平板）

8、稀释级对照组:含50~100cfu/ml菌稀释液→离心→取供试液+稀释液过滤、冲洗→贴平板。这里需要加供试液吗？是否应为上述离心后的菌液？答：不需要取供试液，只取“上述离心后的菌液”。关于这一情况，我在第7题里已经作了说明。

9、当要做稀释剂对照组时，是否就是从制备供试品时就同时做一份不含供试品而是含菌50~100cfu的样品？等于按同一个方法制备一个供试品，五个含菌稀释液对照组？

答：是的。

10、菌落计数是否需要将每天计数的数据登记在记录本上，是否可以只记录最终的数据？

答：可以。每天计数的目的是预防菌落弥漫互相覆盖，干扰最终的点计。你可以用油性笔将每天点计的数记录在培养皿上，发报告时只要最终菌落数就行了。

11、若样品中有不溶物（如片剂中的辅料颗粒），经常会影响培养前期的结果，药典要求逐日计数，所以报告中会出现第二、三日菌落数小于第一日的现象，请问该如何向客户或监检机构解释这种结果？或者是否可以不计第一、二日菌落数，待辅料颗粒与菌落可以区分后再计数？

答：报告书不需要显示第一、第二天的结果，只需报告最终结果。理由请见第9题答复。或者是在营养琼脂中加入TTC试剂（每100ml加入0.1%）

12、由于微生物检验的特殊性，对于样品的微生物限度检查计数数据是否可登记在表格内（此表格仅含样品名称、批号及检查结果）。之后再将检测结果移至详细记录中？

答：原始记录应该只有1份。如果你说的详细记录是属于一般记录，是没有必要的，如果是指报告书，就应该没问题。这要看你自己订的SOP。

13、直接接种法培养后的菌落报告：原液230cfu,稀释10倍后 40cfu,请问按2010版药典的菌落数报告规则如何报告菌落数？

答：报告菌落数为40×10=400cfu。应以菌落数乘以稀释倍数后的最大值作为报告结果。

14、05版药典供试品离心5分钟，而10版药典改用离心3分钟，原来按5分钟验证的产品是否需要重新验证？

答：是的。需要再确认一下。

15、10版药典附录微生物限度检查法中结果判断的菌落计数单位是以“cfu”表示，但正文品种项下是以“个”表示，最终应以哪位为准呢？

答：应该是以cfu为单位。正文是由于印刷时没统一修改过来，关于这个问题，在增补本上修订过来。（在增补本没出来之前，正文品种还是以个为单位）

16、为何控制菌液的浓度为50-100cfu/ml。

答：50-100cfu在平板上比较好点计，菌落不容易重叠。少于50，则实验误差会增大，重现性不好，大于100则容易造成菌落太密或重叠不好计数。

17、药典上控制菌检查的方法验证，只是说把菌加至增菌培养基中检出即可，那我们实际做验证与记录时，是否要做增菌以后的步骤呢？

答：要。不然你怎么知道检出来的菌是你加进去的试验菌呢？

18、采用薄膜过滤法检验，阳性菌，计数是否也用此方法计数？

答：是的。

19、对于10版药典延长培养时间，控制菌35-37℃改为30-35℃培养温度，一些已经验证（按05版药典）检品是否需要重新验证？是否有必要进行延长时间前后菌生长情况变化的验证试验？

答：目前没有相关性规定，我们认为可按原来已经验证的方法，用2010年版的培养时间和温度再确认一下，如果结果符合药典要求，则可用。如果不可行，则调整后再进行验证。

20、若无需都重新验证，那么参照标准为05版药典，又可以通过什么文件来更改为参照10版药典？

答：请看上一题。

21、检验控制菌用培养基促生长能力的检查，也需要对照培养基吗？例如：大肠埃希菌用的BL增菌液。

答：是的。请看附录“微生物限度检查法”中的表2。

22、10版药典增加贴膏剂的检查，狗皮贴膏药属于贴膏剂吗？

答：应该是的。请对照《中国药典》一部附录P8进行确定。

23、请问若试验条件限制未能使用匀浆仪制备非规定灭菌制剂是否可采用温热（不超过45℃）的稀释液？

答：如果能够充分分散样品，可以的。

24、请问若采用薄膜过滤法进行验证，由于过滤难度大，是否可以每膜过滤相当于供试品0.1g，报告以结果乘以10？

答：验证计数时可以的，验证控制菌时检验总量应达到药典要求，如果一张膜检验量达不到，可分几个膜。

25、请问采用静置分层取上清液薄膜过滤，是否需要加稀释剂对照组？

答：个人观点可以不用,但未经验证。

26、供试品静置分层取上清液进行试验，静置3~5分钟，是否经过验证供试品的本底菌不会沉到底部？

答：未经验证。

27、培养基适用性检查，抑制能力检查用菌种是哪些？

答：控制菌的培养基适用性检查,请看药典“微生物限度检查法”中表2，计数用培养基请看“计数培养基的适用性检查”。

28、投料中有神曲提取物，限度应界定为多少？

答：不是药材原粉投料，标准均按“不含药材原粉的制剂”执行。

29、微生物限度检查里有关经验类的东西都必须经过验证才可以使用,那么验证的内容包括哪些数据应记录，是否也应该有文件与记录？

答：参照药典，你是作什么样的检验，就作什么样的验证，有验证就应该有记录。

30、比如10倍稀释级菌落数为0，100倍稀释级菌落数为2，按2005年版药典应以低稀释级菌落数报告为＜10，还是按最高平均菌落数乘以稀释倍数报告为200个/g，是否理解正确？

答：按《中国药典》2005年版报告应为＜10个/g（或ml），按《中国药典》2010年版报告应为200cfu/g（或ml）。

31、计数方法的验证：执行新版药典是否就延长培养时间做方法验证？

答：是。

32、平皿法中提到“每个稀释级每种培养基至少检验2ml供试液”，是每皿注2ml还是每皿注1ml？如要做0.5ml或0.2ml，本级是否还需做1ml?答：常规平皿法时每皿注1ml，做2个皿；培养基稀释法（即每皿0.5ml或0.2ml）时，供试液总量也应是2ml，每1ml菌落数合计后，2ml的菌落数再平均；本级就不需做1ml了，但下一级就只做1ml/皿就行了。

33、在细菌霉菌计数检查中，老师提到的每个稀释级每种培养基至少检验2ml供试液，但2010版药典上并没有要求要这样做，那应以哪个做法为准？

答：药典中对平皿法的描述：平皿法“取供试液1ml，置直径90mm 的无菌平皿中，注入15～20ml 温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2 个平板。”这里的描述是以常规平皿法进行描述的，所以“每稀释级每种培养基至少制备2 个平板”，也就是2ml的量。对于培养基稀释法，请看药典供试液的制备中3. (6) ①。

34、10版药典要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml，（其中10g或10ml用于阳性对照试验）是否指20g或20ml样品中10g或10ml直接用于沙门菌控制检查，另10g或10ml加pH7.0的缓冲液100ml作为1：10的供试品溶液作为细菌，霉菌，酵母菌的检验吗？还是指20g都用于沙门菌检查？

答：20g都是用于沙门菌检查。沙门菌的检查法是：取3份200ml营养肉汤，其中2份分别加入10g或10ml样品，取其中1份加入10~100cfu菌液作阳性对照。第3份加入10ml稀释剂作阴性对照进行检查，所以。细菌，霉菌，酵母菌检验的样品不包括在这里。

35、沙门菌检查为10g或10ml，为何一次检查量又为20g或20ml？（P130）答：其中10g（或10ml）是检验用的，另10g（或10ml）是用于阳性对照试验的。请看上一题目解释。

36、采用薄膜过滤法时，滤膜采用何种方法灭菌最好？

答：据我们经验，最好采用一次性过滤器。如果用多次使用的过滤器，则滤膜用湿热灭菌比较好，因为干热灭菌后，滤膜较脆，试验时不容易保证滤膜完整。

37、方法学验证时，采用平皿法稀释级计数，是否要做稀释级对照组？

答：稀释级对照组？是指本底菌组吗？如果是，那就要。因为要平行试验，才能知道同一稀释级的本底菌是多少。如果是指稀释剂对照组，就不用，因为所用的稀释剂是药典规定的，是无毒性的稀释剂。

38、方法验证的培养基稀释法验证（样品0.2ml）只做2个平皿，每个平皿的加菌量是多少？如果同步加0.2ml菌，其加菌量就达不到50~100cfu。

答：不管每皿加的供试液的量是多少，每皿加菌液的量都是1ml ,即都是50~100cfu。

39、平皿法（稀释法）计数验证时，取最低稀释供试液如0.5ml和50~100cfu试验菌，那50~100cfu的试验菌是指50~100cfu还是50~100cfu∕0.5ml？我们是要加1ml还是0.5ml的试验菌？

答：平皿法（稀释法）计数验证时，每皿要加的菌液是50~100cfu，一般我们配制的菌液浓度是50~100cfu/ml，所以就加1ml。如果你配制的菌液不是这个浓度，你可以折算，只要加的菌数是50~100cfu/皿就行了。

40、细菌霉菌方法验证，同时做1ml，0.5ml，0.2ml供试品组及供试品验证组时，菌液是否也按1ml，0.5ml，0.2ml分别加入？此时1ml，0.5ml，0.2ml供试品验证组中的菌数能否也达到50~100cfu？

答：验证时，不论是1ml，0.5ml，0.2ml的供试液，每皿的加菌量都是50~100cfu，即1ml（如果你配制的菌液浓度是50~100cfu/ml）。

41、培养基稀释方法验证，每皿0.2ml，加菌液0.2ml，那么0.2ml的菌液计数是否在50~100cfu∕0.2ml。

答：请看上一题的解释。

42、微生物限度检查霉菌、酵母菌要求不超过100的情况下，这两种菌是不是要分开来检，用不同培养基检测？目前只用玫瑰红钠琼脂培养基检测这两种菌，有没有必要修改？

答：按药典规定，一般品种是用玫瑰红钠琼脂培养基检测这两种菌；含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。

43、测表面微生物时，直接接触药品与间接接触药品的限度（≤25）一致，是否有不妥，如果有不同意见，可否提供其计数方法？另外，如果检测到菌落数超过100以上，那么报告规则的菌数也是取两位有效数字吗？

答：“测表面微生物”？这应该是药包材的检测标准吧？由于我们尚未开展这项业务，所以对其标准情况不了解，但既然已经成为标准，就肯定有其合理性，如有不同意见，可向标准制订部门反映，并提出你认为合理的解决办法。微生物的报告规则一般都是取两位有效数字。

44、内包装材料PVC硬片，铝箔等样品的微生物检验（限度）方法？

答：是药包材的检验？应该有相应的检验方法吧！

45、控制菌检查，大肠埃希菌IMViC试验，结果显示未检出，有没有硬性规定必须要进一步鉴定？

答：对于大肠埃希菌检查，IMViC试验已经是鉴定试验了，如果IMViC试验结果显示未检出，那么就可以报告未检出大肠埃希菌。

46、菌数报告按两位有效数字报告，是按数字修约方法进行数据修约，还是只用保留两位有效数字，如菌数为364报告菌数为360，还是370；若菌数为3670报告菌数应为多少？

答：修约原则是4舍6入5留双。即菌数为364报告菌数为360；若菌数为3670报告菌数应为3700；如果是3650，则报告菌数应为3600。

47、在日常检验中控制菌检验方法通过验证的控制菌检验可否不做阳性对照？理解：在验证时已做过控制菌+供试液，验证时供试液对控制菌无抑菌性，若只是做控制菌（不加供试液）则在培养基适用性时已证明培养基的质量，那么每次试验做阳性对照的意义是什么？或者阳性对照试验怎么做？

答：从理论上来说是可以的，验证试验实际上就是检验时的阳性对照试验。但药典要求控制菌检查时必需同时从阳性对照和阴性对照，这应该是考虑到检验过程的检验系统的误差吧。本人认为，生产厂家对自己的产品在经验证后，检验时如果每天同一产品批量很大，可以只做一个阳性对照，但对于药检所则必须每批都做，因为对于同一品种，不同厂家其生产工艺不尽相同，在检验过程中对被检微生物的干扰也不同。因此，药检所应每批都做。

48、取样量药典要求“从2个以上最小包装单位中抽取供试品”，是否包括2个？

答：包括。

49、请问药厂自行做的微生物方法验证是否需要经过药检所的审核？若产品更改为辅料，重新做方法验证，是否需要到药检所备案或需要药检所审核？

答：药厂自行做的微生物方法验证不需要经过药检所的审核。同样，重新验证后也不需要。但如果你的检品需要报注册检验，则你必需提供你的整个验证资料，药检所将根据情况对你的方法进行确认，看方法是否可行。

50、是否每次做培养基适用性都必须与对照培养基进行比较？如果第一批培养基与对照培养基比较回收率为90%，那么第二批培养基与第一批培养基比较回收率为80%，则折算为第二批培养基与对照培养基比较回收率为72%，之后购买的培养基与前一批比较，而不用每次培养基适用性都与对照培养基比较，这样可不可行？

答：请按药典要求做，至于内部控制则要自己掌握。但你要保证第一批培养基在你用于与第二、第三批比较时，质量保持其与对照培养基比较时一样，因为随着时间的推移，培养基的质量肯定有所下降。

51、微生物检验验证时，如我用一瓶普通脱水培养基与对照培养基测定菌落数，如普通脱水培养基符合适用性检查，那么该瓶普通脱水培养基能否作为以后工作中的对照培养基来用？

答：请看上一题的解释。

52、培养时间有要求24~48h，也有要求24~72h的，像这种时间要求范围比较大的情况，如果在最短的时间内（如：24h）就已经长菌，但需进行后续实验判断该菌是否为控制菌，那么，是否需要培养到最长时间（如：48h或72h）再进行后续实验？

答：长势好的话可以进行后续实验不用等到最长时间。

53、操作结果的RSD%的范围比较宽裕，是否可信？（eg：黑曲霉若＞20cfu∕皿时，菌落将扩散至难以分离，所以回收率精确度较低）

答：这个问题要具体问题具体分析。菌落漫延，这是要求逐日观察的主要原因之一，应在菌落能分辨的时候点计菌落数。加菌量太少，容易出现误差大，重现性差，所以要求加的菌数在50~100cfu。

54、含药材细粉的胶囊如何制备供试液？

答：按固体制剂供试液的制备方法制备，可用45℃水浴软化溶解胶囊壳。

55、大肠菌群检查，需阳性对照吗？

答：要的。阳性对照菌为大肠埃希菌。

56、菌液涂布时，用接种棒还是涂布棒涂？

答：用L型涂布棒，也可用玻棒自制。

57、控制菌的培养基促生长能力检查，对照菌加于固体培养基如何涂布，用什么工具来涂布？

答：请看上一题。

58、三部药典中有些产品细菌数、霉菌和酵母菌数用每g多少cfu，但有些为每g多少个，应怎样记录？

答：应该是cfu才对的，这些应该是在转版时没转过来吧，在增补本应该会转过来。但是在没转过来之前，它还是法定的，必需按药典上的写法来执行。

59、如样品的控制菌为大肠埃希菌没检出，但检出其它种菌，结果该怎样判定？

答：如果是其他致病菌，请看微生物限度检查法的结果判断第一句。

60、我们是做糖衣片的，微生物限度检查吸取供试液时，吸管有时会被粉末塞住，那能不能让供试液沉淀后取其上清液呢？这样操作结果可靠吗？

答：请将药片尽可能打碎，如果还不能解决问题，我们的经验是：可让大药渣沉降后取上层液进行试验，但沉降时间尽可能短(在3-5分钟内)，这样做对结果会有一定影响，但应该在可接受范围内。

61、微生物限度检查控制菌检查时，如供试液的增菌后无菌生长，可否直接发供试液的未检出控制菌，此时，阳性对照试验还需继续做下去吗？

答：只要能判定供试液增菌后无菌生长，阳性对照试验菌长出，就可发未检出控制菌。

62、如何理解“菌落蔓延成片不以计数”？如10-1级有1个皿的菌落成片是否用10-2级来计数？

答：是的。

63、如何避免菌落成片？

答：1、培养基倾注时温度不宜过高，可减少倾注后培养皿里的水蒸汽太多而造成菌落容易漫延，或者加盖“陶瓦盖”吸收水蒸汽；2、细菌计数时，在每100ml营养琼脂培养基中加入灭菌的1%氯化四氮唑0.1ml，可使生成的菌落变红色，容易点计，也可在一定程度上抑制菌落漫延。

64、请问一下对于生长速度快、易蔓延的菌有什么好的方法控制，该如何计数，如采用陶瓦盖培养时间要不要延长？

答：请看上一题的说明。如用陶瓦盖，培养时间不需要延长。

65、请问若细菌、酵母菌平均菌落数不在其宜选取的范围内，即大于300及100cfu时，该如何报告菌数？另05版药典的规定范围是30~300/30~100，倘若当菌落数大于300及100，如何报告？

答：应该重新试验，将稀释级再往高级进一步稀释，直到能有可报告的稀释级。可在工作中以对产品的认识将稀释级调整到可报告的级别进行检验。

66、请问对于抑菌性难以消除的粉末状样品，采用最好的消除抑菌性的方法是什么？

答：如果能溶于水，目前来说，最好的除菌方法是薄膜过滤法；其次是找到相应的中和剂。

67、我们生产的产品为外用搽剂非无菌产品，需要对所有原辅料做微生物限度检查吗？

答：生产企业对原辅料的微生物限度检查，应根据自己的情况进行控制。参见一部附录P88（或二部附录P116），微生物限度标准 第7点。（个人意见：如果所用的原辅料直接投料，就要控制，如果还要进一步提取等，则可通过控制中间产品的微生物限度来控制。）

68、原辅料是否要单独做方法验证？

答：所有要检查微生物限度的品种（当然包括原辅料），都要做方法验证。

69、中药材的微生物限度如何检测？如超标应如何控制？

答：1.中药材的微生物限度检查，参照固体制剂的供试液制备，并根据给药途径执行标准，如用于直接投料至口服制剂的，还应检大肠菌群。2.如超标，具体问题具体分析。

70、中间产品可否不做微生物检测？

答：中间产品应该控制微生物限度，各企业应内部质控相关的具体要求。

71、厂家用10-2稀释级作验证，那我们药检所作检查时是否从10-2稀释级开始做？

答：是的。

72、省所做微生物限度时，厂家没有做验证，那省所是自己做验证，还是退回去？又或者厂家的控制菌验证没有做全（例如漏了沙门菌没做），那省所怎么处理？

答：1、如果是注册检验，厂家没有做验证，我们是不会接收样品的，也就是说，没做验证或验证不全，肯定退回去。 2、如果是委托检验，由于是协议性质，我们就按协议进行检验。

73、微生物限度检查时，只有细菌数不合格，那么复试是否可以只做细菌数检查就行了？

答：可以。

74、样品制备中，如羧甲淀粉钠等崩解剂遇水膨胀，经试验1g∕100ml仍为胶体浆糊状，无法过滤且难与培养基融合，再加大稀释倍数，则代表量太少，请问这种辅料采用何种方法进行微生物限度检查？

答：羧甲淀粉钠应该没有抑菌作用，无法过滤可用平皿法进行检查，且供试液制备时，稀释剂的温度适当调低些。

75、若样品对微生物生长有促进性，采用薄膜过滤法应如何消除此影响，或者有什么其他方法可以消除促进性以获得更准确结果？

答：采用薄膜过滤法就是很好的消除影响的方法；药典上规定“供试液从制备到加入检验用培养基不得超过1个小时”，就是考虑到样品对微生物存在促进或者抑制作用的影响。因此要获得更准确的结果，就必需尽量缩短从供试液的制备到加入培养基的时间。另外，也可根据样品的特性有针对性的加入中和剂等。

76、控制菌检查对于大肠的检查，MUG试验中显阳性或难以判断时，“将培养液转接到EMB”，这里的培养液是指MUG还是之前扩增的BL？

答：药典上并没有“将培养液转接到EMB”这一描述。但对于MUG和靛基质试验结果不一致时，是这么规定的：“如MUG 阳性、靛基质阴性，或MUG 阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24 小时。”

77、胆香鼻炎含有猪胆汁膏，毛鸡药酒含有毛鸡浸出夜，霍胆丸含猪胆粉，这三个产品需要检沙门菌吗？

答：是的。（因含猪胆汁膏、毛鸡、猪胆粉）。

78、微生物检验时，匀浆机应把转速调到多少才不会对微生物有损伤？

答：没有相关的规定，目前一般使用转速为3000-4000转/分钟。

79、如果使用药典以外的培养基进行微生物限度检查（比如TSA），怎么进行培养基适用性检查，是否有合适的对照培养基？

答：可以参照“药品微生物检验替代方法验证指导原则”对所用培养基的质量进行控制。至于是否有相应的对照培养基，要看中检所是否来得及研制。

80、微生物限度检查的方法验证，至少应进行3次独立平行试验，每个独立平行试验可否使用不同批号的样品？

答：可以，且最好是用3个不同批号样品进行验证。

81、每个独立的平行试验是否有必要用3个不同批号的样品进行验证？

答：用3个不同批号的样品进行验证，可以增加验证结果的重现性。

82、微生物限度检查中，培养基的适用性检查时对每个批号的培养基进行还是对每次制备好的培养基进行？

答：请看《药品微生物实验室规范指导原则》中，关于培养基第3点，质量控制试验的描述：“除药典附录另有规定外，在实验室中，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可只进行一次。如果培养基的制备过程未经验证，那么每一批培养基均要进行适用性检查试验，试验的菌种可根据培养基的用途从相关附录中进行选择，也可增加从生产环境及产品中常见的污染菌株。”

83、能否举例说明哪些培养基是指示能力检查培养基？

答：请看“微生物限度检查法”中表2。

84、05版SOP中有说经验证后控制菌可以不用做阳性对照，10版是否有相同的说法？已建立控制菌方法是否还需作阳性对照？

答：药典规定，控制菌检查必需同时检查阳性对照和阴性对照。05版SOP《中国药品检验标准操作》中并没有说经验证后控制菌可以不用做阳性对照，不知你所说的是那个SOP？

85、请问化药软胶囊还需要检沙门菌吗？

答：如果是口服制剂、有动物药投料就必需检查。

86、微生物方法验证过程中，供试液的制备，检细菌与霉菌及酵母菌处理不一样，这样方法是否能成立？

答：完全有可能。检查方法是经验证的，对于有抑菌作用的品种，经验证后细菌计数方法与霉菌及酵母菌的检查方法不一样，这很正常，只要方法是经验证，符合药典要求就可以。

87、2010版药典控制菌培养温度降低到30~35℃，那么以2005版药典验证过程控制菌检验方法，2010版药典还需要再验证吗？

答：是的。

88、检大肠埃希菌时，MUG观察一定要5小时观察，是否可以只在24h观察？

答：可以。

89、培养基适用性检查涂布时如何考虑（或消除）涂布棒上沾到菌落的影响？

答：涂布时，试验用培养基与对照培养基都同样操作，所以这个影响是同等的，可不需考虑。

90、纯化水要多少ml过滤，是不是原液要不要冲洗液冲洗？要不要阴性对照？

答：过滤多少ml可根据样品微生物污染的程度来决定，只要最终每膜上的菌落不超过点计要求（即100cfu）就行了，结果报告时将菌落数除以ml数即可。可以不用冲洗。必需做阴性对照。

91、用稀释法检验控制菌的时候，金黄色葡萄球菌是10ml（相当1g，1ml）至500ml肉汤，能否用2ml至100肉汤？

答：可以，但应该同时做5份，使检验用的样品总量达到1g（或1ml）。

92、保留2倍有效数字（细菌，霉菌报告数）如果检出细菌是1160cfu/g，是否报告数必须写成1.1*103cfu/g，还是直接写1/100（不过这样好像不是2倍有效数字）。

答：报告数应该写成1.2Χ103cfu/g或1200cfu/g。

93、怎么证明微生物限度中加入的表面活性剂，中和剂或灭活剂的生长和存活无毒性？是在验证中做稀释剂对照组就可证明是否其无毒性了吗？还是？

答：是的，在验证中做稀释剂对照组就可证明是否其无毒性。

94、平皿稀释法时，若每一个平皿加入0.5ml供试液，那么，阴性也是加0.5ml吗？还是阴性加1ml？

答：阴性是检验检测系统是否受微生物污染的试验，应该是取1ml稀释液。

95、辅料中的香精（如杨梅香精），滑石粉是否按非水溶性制剂供试品处理？氢氧化钠又如何处理呢？

答：香精和滑石粉，如果能分散于水中，或者加表面活性剂后能分散于水中就可以，不一定非要按非水溶性制剂制备供试液。氢氧化钠可溶于水，可按普通检品检验进行验证处理。

96、有两种制剂形式的原料药该如何制定卫生学指标呢？如一种原料药可用于口服制剂以及外用制剂？

答：可以按要投料的剂型进行控制，或者直接按要求严格的一种来要求。

药典培训班问题解答3：

1． 是否只是添加了抑菌剂的注射剂才需要做抑菌效力检查？没有添加的就不需要了，是吗？

抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产企业在制剂研发阶段抑菌剂的确定。要求具有抗菌活性的制剂（参见制剂通则），不管是添加的抑菌剂，还是药物本身具有抗菌活性，在药物研发阶段，均应确认其抗菌效力

2． 抑菌效力实验中“菌数测定方法需经验证”是指示品种方法验证时的方法还是需重新做验证？

抑菌试验所加的菌与品种微生物限度检查法验证时所用的菌有所不同，这里的“菌数测定方法需经验证”，是指样品对试验时所加进的菌，在经样品作用后的剩余的菌数。与品种的微生物限度检查法的验证不同，所以必须重新验证。

3． 培养基抑制能力检查接菌量不少于10cfu，有无上限要求？若无，直接加菌的原液是否可以？

没有上限要求。理论上可以。

4． 对日化产品作细菌/真菌防腐挑战，采用单一菌种10 ­6细菌浓度，2~3种真菌10 ­5进行挑战是否合理？

根据产品的性能，功效以及所含防腐剂的最小抑菌浓度确定。

5． 目前我国化妆品防腐挑战与美国CTFA的方法区别在哪里？哪一种方法更为严格？

CTFA的方法初始的霉菌和细菌的接种量分别为10000cfu/g（ml）和1000000cfu/g（ml）（CFU为菌落单位），要求在第7天时霉菌降低90%，细菌降低99.9%，并且在28天内菌数持续下降。

国内参照CTFA加菌防腐挑战性试验 初始接种细菌量1000000 cfu/g（mL）

（1）第28天时，样品中含细菌或霉菌＞1000cfu/g（mL）该样品不能通过微生物攻击的挑战试验，表明样品的防腐体系不能有效地志到抑制微生物的作用，产品在生产、贮藏和使用中很容易受到微生物的污染。

（2）第28天时，样品中含细菌或霉菌在100 cfu/g-1000 cfu/g（mL），该样品有条件地通过挑战试验，即当产品中蛋白质或其他动植物材料成分不是特别高，同时生产的卫生环境符合要求，包装物不易发生二次污染时，该防霉体系可以使用，否则不能。

（3）第28天时，样品中含细菌或霉菌在10 cfu/g-100 cfu/g（mL），表明该样品的防腐体系对微生物有较强的抑杀效果，通过挑战试验，产品在生产、贮藏和使用时不容易受到微生物污染。

（4）从第7天起，样品中的细菌或霉菌＜10 cfu/g（mL），说明该样品的防腐体系对微生物有特强的抑杀作用，通过挑战试验，产品在生产、贮藏和使用时很不容易被微生物污染。

6． 对于密封性较好的产品，如喷雾剂瓶装，用何种微生物检测方法更能较客观地模拟实际使用过程中微生物污染的风险？

推荐采用薄膜过滤法按该产品日常用法在不同规定时间点取样检测。

药典培训班问题解答4：

1.    含琼脂培养基冷却至25℃后已凝固，如何测定其ph？

答：有专门的固体培养基pH计，如Radiometer A /S, DK22400 Copen2 hagen NV, Denmark 或者Microelectrodes Inc1, NH 03053,U1S1A1 。".

8.PH计测培养基的PH好像有比较大的差别，应如何选择PH计？（效价7.8的培养基我用普通理化室的PH计测定只有7.0左右，不知道是否因为在高温下测定（含琼脂）

答：培养基应冷却到20℃～25℃才可测量，另外PH计应按时校准。

9.生物指示剂对灭菌设备的性能，灭菌程序的验证是只验证一次呢，而后进行定期验证，如果生物指示剂换批号，是否要重新验证？

答：应定期或不定期验证一次，确保灭菌设备正常。生物指示剂更换批号，不需重新验证。

10. 紫外线灭菌后，需要多久进去操作？

答：打开通风净化设备，半小时后可入内操作。

11. 孟加拉培养基是否可以取代玫瑰红钠琼脂进行培养霉菌和酵母菌？

答：根据中国药典，采用玫瑰红钠琼脂。

12.配制PH值7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液时有时因为高压灭菌器灭菌过程温度过高而导致培养基混浊了，这种情况缓冲液还能用吗？ 

答：建议按正常温度灭菌，混浊培养基建议不要使用。

13.培养基在冷藏中形成结晶怎么处理？①销毁 ②加热再用 ③待冷却完用 

答：建议不要使用

14.融化的培养基为什么不能再冷水中冷却？

答：防止受热不均引起结块

15. 取菌后测PH：（25℃）培养基配制好测PH，取其中一瓶测PH，那这一瓶测完就不能用了，污染了。 

答：也可在无菌条件下取出适量测ph.

16. 配制分装过程中能否使用不锈钢锅？

答：我实验室使用不锈钢锅，目前未发现异常。

17. 对新购进无菌0.9%氯化钠（500ml）能否再次灭菌？

答：能。但包装完好，购入时间较短的无需灭菌。

18. “要定期对压力表进行检定（消毒锅），检定周期一般为半年”，这句话怎样理解，是厂家应半年自己检一次，还是有计量部门执行？

答：由计量部门计量，计量后应发有检定证书。

19. 灭菌后，灭菌锅需自然冷却降压才可以打开，这段时间是否会造成过度灭菌。

答：自然冷却过程已经计算在正常灭菌时间内了，不会造成过度灭菌。

20. 培养基常规质控有无强制检定项目？目前我们所做项目有：ph、无菌检查、生长检查、是否符合药典规定？

答：培养基应按2010版药典检查。

21. 培养基所用器具若使用湿热灭菌，是否必须待干燥后才可以使用？若烘干或其它方法，中间过程怎样防止微生物污染？

答：答：如果是马上使用且不是用于非水溶性供试液的制备及实验，不一定要烘干；否则，应干燥后使用，灭菌及干燥尽量在同一锅里进行，或用纱布和牛皮纸包扎紧密。

22. 培养基的避光储存，是否配置好的培养基其全部放避光储存？

答：最好都避光保存。无条件时，光敏感的培养基一定要。

23. 商品培养基干粉说是加蒸馏水溶解，实际操作是否可以用纯化水或注射用水？

答：只要不含有任何可能抑制或影响微生物生长的物质的水均可。

24. 灭菌后的培养基是否都要测ph值？如何测定ph值？

答：每个制备批次的培养基都应测定ph，可采用ph试纸或ph计测量。

25. 培养基及器具灭菌可否同一设备同灭菌时间进行灭菌？答：最好分开灭菌，条件不允许时可同炉灭菌，前提是都是洁净无污染的。

26. 培养基的保温能否用60℃的培养箱，它与45℃—55℃水浴锅保温方法有何不同？

答：不建议，因为温度不同，长时间高温影响培养基质量。

27. 培养基的贮存是否需要放置于2—10℃冰箱内？

答：需冷藏保存的培养基外包装上会写明。

28. 培养基灭菌后成份会有所蒸发减少，如何处理这个问题？答：正常情况下蒸发量较少，可忽略不计。

29. 培养基融化后出现浑浊是有哪些方面的原因引起的？应如何避免？

答：可能的情况有1培养基配置用水不符合规定；2灭菌过程温度升温慢或降温慢；3培养基储存不当；4融化时沸腾时间较长等。

30. 准备好的培养基有效期如何验证？

答：定期取出培养基验证其无菌性，促生长能力等方面。

31. 某些培养基无pH变化范围，应该怎么确定该培养基的pH范围呢？

答：向培养基供应商索取。

32. 用于环境监控的培养基预培养时间如何确定？

答：与正常实验的培养时间应一样。

33. 培养基加热的温度一般超过100℃，是否符合要求？有无时间限制？

答：答：是指哪个环节？培养基灭菌温度规定是超过100℃，有具体的时间要求，如果是指固体培养基使用前的加热熔化，则完全融化即可，避免长时间高温加热。

34. "培养基瓶的装量,例：瓶装量是500ml/瓶，装量超过500ml/每瓶是否可行？

答：培养基的分装量不得超过容器的2/3。"

35. 同一批培养基代表同一批号生产的培养基吗？

答：是。

36. 培养基配制好灭菌后，在高压容器中保温降至50℃左右，可不可行？

答：建议最好不要，避免过度受热。

37. 脱水培养基对湿度是否有要求？多少适宜？

答：按要求阴凉干燥环境储存即可。

38. 对照培养基何时能购买？

答：已经陆续开始销售。

39. 培养基pH值测定温度在25℃，这个温度应怎么控制？比如固体培养基，固体培养基使用过程中还能调节pH值吗？

答：可水浴控制培养基温度。

40. 配制培养基过程中，按说明书称定量，加规定的纯化水，煮沸溶解，为了避免煮沸过程总减少水分，是否要在配制过程适当增加水?比如陪硫乙醇酸盐流体培养基.

答：可适量增加，自己掌握。

41. 商品培养基可否按照使用者验证的参数灭菌？

答：理论上可以，请自行掌握。

42. 商品培养基一定要当天配当天用吗？可否在一周内用完？

答：不是即配即用的培养基的话，储存的当，可以使用。

43. 称量培养基时，注意不要吸入粉末，这粉末是指何物？

答：就是你所称量的干粉培养基

44. 从中检所购买的培养基还需要做适用性检查吗？

答：因为也是大批量生产的商业化培养基，应该做适用性检查。

45. 若商品化的脱水培养基说明书上的处方与药典上的标示的处方不符的，不能用吗？

答：不能。

46. 用于调pH值用的酸、碱溶液经灭菌后会对Hcl溶液，NaOH溶液发生物理、化学变化吗？如果有变化影响，会影响到所调培养基的质量吗？

答：理论上会，但未经试验证实。

47. 如果购买的预灌装培养基，是否需要做培养基灵敏度？答：需要。

48. 购买回来的培养基有几个批号，那么适用性检查是只需做一次？还是每个批号都需做?

答：每批都需做

49. 如果不同次买回来的培养基是同一批号，是否后面买回来的培养基不需要做适用性检查?

答：最好做

50. 如果配制和灭菌过程没有验证，是否每一次配制培养基均应进行适用性检查？

答：是。

51. 生物指示剂菌片浓度液如何进行复核？才可确认所购买生物指示剂菌片浓度符合要求.

答：我所未使用该产品，无此方面经验。

52. 紫外灯的使用期限，怎么规定，通常多长时间更换紫外灯？

答：每种型号的使用寿命不相同，有1000小时、1500小时、2000小时等，买来时应仔细阅读说明书。

53. 培养基灭菌，若规定为121℃15分钟，实际操作为（121+2）℃，（15+3）分钟，这样可取吗？是否只能按照培养基配制121℃15分钟说明来配制？

答：建议按照规定时间进行灭菌。

54. 培养基的灭菌程序如何验证？

答：可采用生物指示剂进行验证。

55. 煮培养基，用不锈钢锅在电磁炉上煮可行？硫乙醇培养基是否要煮沸？如何煮沸？用不锈钢锅在电磁炉上煮沸可行吗？可不可以水浴煮沸呢？

答：硫乙醇应煮沸，量大时，我实验室用不锈钢锅在电磁炉上煮沸。

56. 从中检所购买的培养基还需要做适用性检查吗？

答：因为也是大批量生产的商业化培养基，必须做。

57. 在灭菌条的效力验证时选取微生物指示剂，由于我公司产品品种多，同一种微生物指示剂又存在着在不同介质中耐热性（D值）不同，那应如何测定某微生物指示剂在某一介质耐热性（D值）呢？应如何选取最适宜的微生物指示剂呢？答：选择生物指示剂，应以所选用的灭菌方法向对应。

58. 各种成品培养基要求的灭菌温度与时间不一样，做灭菌锅的验证应该如何确定温度和时间？

答：我们未遇此种情况，但认为应按照最低温度和最短时间进行验证。

59. 琼脂平板最好现配现用，但现有规定要求培养基需要经适用性检查后才可使用，时间上的冲突如何解决？

答：一个批次的培养基做一次适用性检查即可，以后再使用时可现配现用。

60. 培养基（微生物限度用）是否需作无菌性检查？若培养基还需作阳性生长试验，那么无菌检查与阳性检查是否应分区域进行？

答：按药典规定进行验证。阳性应在专门区域内进行。

61. 是不是有一种1ml的沙土培养管（用来传代接种），在哪里可以买到？

答：我们未用过，不清楚如何购买。

62. 固体培养基能存多久？（已灭菌的）融化的培养基在水浴中不超8小时，而它呢？

答：视培养基种类而定，不可一概而论。

63. 可否使用紫外线强度指示卡来检测紫外灯是否需要更换？

答：我们未用过紫外线强度指示卡，我们了解有一种紫外线强度检测仪大概可以满足你们的要求。

64. 如培养基在高压灭菌器中温度需自然下降20度才开盖吗？

答：高温灭菌器有安全阀，温度下降到安全阀可打开时将培养基取出室温冷却，各型号灭菌器安全开盖温度不尽相同。

65. 稀释液灭菌后ph值是否有变化？有何影响？（如ph7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，ph6.8无菌磷酸盐缓冲液）

答：一般pH有下降现象，约0.2左右，不同培养基pH变化可能不同。

66. 省所能否帮企业代购“对照培养基”？如能，如何联系？

67. 对照培养基在省所可以买到吗？

答：中检所已经陆续开售，请与我所业务科直接联系（020-81854392）。

68. 按要求每批培养基要做系统适用性验证，下面分所或厂家如直接从省所购买，省所买回来的时候肯定每批已已验证了，那下面分所还要做验证的话，那不就大大的浪费人力、财力、物力。可否省所购进的不验证或提供验证报告？

答：各实验室配制培养基的程序不同，必须自己做验证。

69. 有些培养基要用到梭菌等，下面所可能一两年也没检测阴道内用药，也很少用到这个菌，按验证要求，就得把各种菌买回去，还得花很多时间去维护、保管、传代等，下面有些药厂这方面的人才就更加稀缺，这就逼得很多厂家为了应付检查做更多的假记录或买N支菌回来这只是为了应付检查。答：这种情况我们能理解，但是还请按照药典规定处理吧。

70. 配好的MUG有没有要求多长时间内要使用完？可以一次过配很多，用上几个星期？

答：请按药典中对培养基的一般要求操作。

71. 配好的靛基质有没有要求多长时间内要使用完？可以一次过配很多，用上几个星期？

答：请放冰箱保存，我们的经验可使用一到两个月。

72. 对照培养基中检所还是没有卖，在10月1日未买到对照培养基之前，可否沿用05版药典来确认培养基适用性？

答：在未买到之前，请尽量购买有资质的品牌培养基。尽快按10版执行。

73. 大肠埃希菌检查时，MUG培养基必须在5小时和24小时，两个时间段做观察？还是选其中一个适应的时间点作观察好？

答：如5小时可以明显观察到结果，就可做进一步检查。

74. 我公司是生产大容量注射液的，由于国家对灭菌效力F0值的要求不断提高，结合我公司现行灭菌条件所达到的F0值不高，故必须进行灭菌工艺变更，在灭菌工艺变更中，需做灭菌效力验证，需选取适宜的微生物指示剂。但由于我公司品种较多，同一微生物指示剂在不同品种药液中会有不同的耐热性（D值），这影响到我公司对微生物指示剂的选取，请问国内对耐热性较高的微生物指示剂的耐热性测定是怎样的办法？

答：我们未做过此类研究，请咨询相关产品公司。

暂不能解决的问题如下：

1.培养基PH测定：如做效价用的培养基会有琼脂，25℃时已凝固，应怎样测？ 

2.    培养基ph测定时，因营养琼脂、玫瑰红钠琼脂在25℃时才会凝结成块，如何采用ph计测定？ 

3.    灭菌后培养基冷却至室温25℃时，含有琼脂的培养基已凝固，请问此时如何测定其pH值？如何防止其受污染？

4.    含有琼脂的培养基灭菌后的pH值如何测定？

5.    培养基灭菌后，25℃时有些会是固态，如何测定pH值？

6.    培养基测定pH值，如果是营养琼脂培养基在25℃是凝固，怎么测定？

药典培训班问题解答5：

请问：以第五代菌做阳性对照，实验过程中的接种按药典应该也算传代，那是否算是第六代菌呢？答：依然算第五代(接种的菌株算第5代，培养后算第6代)

      其实验结果是算哪一代菌的？答：见上题

      药典规定只能传代五次，此次实验结果是否有效？答：有效

      现在有无对照菌种可以购买？联络电话？答：省药检所业务科销售药典规定的标准菌株，为第二代甘油冻存管，电话：020-81854392

      菌种发放单应包括什么信息？答：根据自己工作的需要，大致包括：菌种名称，编号，来源，接收日期，接收人等。

      如何检查黑曲霉孢子悬浮液孢子含量为50~100个／ml。铜绿假单胞菌单菌如果用甘油冷冻管，也是低温，是否也会影响它的活性？应如何保存？答：可用玫瑰红钠琼脂培养基或改良马丁琼脂来确定黑曲霉孢子悬浮液。铜绿假单胞菌应使用最终甘油浓度为20%的甘油冻存管保存，保存在-30℃或更低温度，则可保持其活性。若是斜面或营养肉汤，建议室温保存。

      工作菌株，25℃下可连续使用一周，这里的工作菌株是指原液还是制备好的菌悬液。为何工作菌株不低温存放，而是25℃？答：首先要说明，所有的操作应按药典要求来操作，这里的工作菌株指原液，工作菌株建议在2-8℃保存，但要注意的是，铜绿假单胞菌的工作菌液不能低温保存，低温会损伤其活性。由于笔误，写成了25℃，请更正为2-8℃。

      简单方便的厌氧培养方案？答：硫乙醇酸盐培养基；固体培养基的话可考虑使用一次性厌氧袋。

      甘油冻存管一定要－30℃吗？0℃以下不可以吗？答：详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页。我们的甘油冻存管保存在-30℃。

      三糖铁斜面穿刺会断层，这是为什么？  答：产气菌产气使培养基断层，或培养基本身质量问题。

      第一代菌种可不可以作为工作菌株使用？ 答：我们不这样使用，因为担心菌株没有充分复壮，生化特性可能不典型。

      制备菌悬液时，要使其在10~100cfu中，应多注意的地方是什么？答：制定标准化操作规程，减少不同实验者带来的误差，接种量、培养温度和时间应每次一致。

      铜绿假单胞菌不宜放冰箱内保管，但其营养肉汤液能否放在冰箱保管？答：详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页。能否放冰箱可自行验证。

     

      黑曲霉的存放期如何验证？答：通过孢子悬液计数和菌落特征，进行验证。

      标准储备菌株必须进行纯度和特性确认？还是在必要情况下才做？答：详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页，我们在制备标准贮备菌液前进行纯度和特性确认，最好在使用前再进行纯度和特性确认。

      铜绿假单胞菌贮存温度应为多少度？答：一般在10℃以上，甘油冻存管至少在-30℃以下。

      制备工作菌种进行菌种保藏中的保存期是否要进行验证？答：可参考2010年版《中国药典》标准操作规程（SOP），应进行验证。

      验证用菌株可否使用ATCC？答：如果按中国药典检验的，用CMCC

      菌种鉴定该如何做？答：请参考讲义内容。

      药典菌悬液制备是要菌种的新鲜培养物接种至培养基中，培养18-24h再进行稀释，制备菌悬液，可否直接使用未过期工作菌种进行稀释来制备菌悬液？答：按药典要求不行，如要使用，请自己验证。。

      斜面低温保藏法：每一次的菌种传代都需要做菌种纯度鉴定吗？答：建议制备斜面保存管前进行菌种纯度鉴定，以后的每次传代视具体情况而定。

      如何比较快速有效判断菌液的浓度？除了可以用“比浊仪”参考，还有什么方法？答：比浊仪只做辅助参考，还需通过平板计数来最后确认菌液的浓度。

      曾于中检所中购买过黑曲霉的0代包子悬液，说明书上表示应于-20℃中保存，可保存一年，对于此保存唯独及效期，药企可否同法保存自制的黑曲霉孢子悬液？是否要验证？如何验证？答：黑曲霉孢子悬液制备请参照2010版药典的相关内容。关于验证在前面的问题中已经回复。

      菌种纯度确认，怎么确认，需确认哪些项目？答：请参照2010版药典的相关内容。

      细菌菌种接入营养肉汤中保存一周，这需要验证吗？答：建议做验证。

      菌种斜面最多能保存菌几代？经冰箱保存的斜面菌种是否需复苏二次才能进行菌悬液配制？答：药典规定，菌种传代不应超过5代。冰箱保存的斜面菌种复苏后即可使用。

      革兰氏染色的时间一般多长时间，染色时间长了对结果有无影响？答：详见讲义内容，应严格控制染色时间，否则对结果影响很大。

      哥伦比亚血琼脂平皿生长的菌落，对氧化酶试验是否有影响？菌悬液的制备过程中，接种菌种新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，这个新鲜培养物怎么理解，冰箱保存斜面菌种是新鲜培养物吗？答：没使用过哥伦比亚血琼脂及相关实验。新鲜培养物指刚培养好的菌株，冰箱保存斜面菌种不算新鲜培养物。

      菌种鉴定时，一定要根据药典的所有试验做完，才能确认是某种菌株吗？可否省略一些试验？答：请按药典规定来进行菌种鉴定，具体情况可能还要增加适宜的鉴定试验。

      工作菌株可在25℃连续使用一周，是指同一代同一管的菌株吗？还是说同一代不同管的菌株？答：笔误更正，同上一题。

      若没有比浊仪，用什么方法来确认50~100cfu/ml？特别是孢子？答：孢子计数建议通过平板计数的方法来确定浓度。

      工作菌种是否可以使用后再次冷藏使用（斜面保藏法）？答：请自行掌握。

      大肠埃希菌镜检时，有时固定好的菌在染色过程中脱落，请问是什么原因引起这种情况？答：首先，洗干净拨片，挑菌注意不要太多，待菌固定好后再进行染色。

      生孢梭菌，菌落培养计数时一定要在厌氧条件下进行吗？答：是

      菌悬液怎样在24h内确定其菌落数？请讲解细菌和真菌的方法.答：平板计数方法。

      生孢梭菌培养时，怎样做才能使其在厌氧中培养？答：详见2010版药典

      菌种的纯度鉴定包括哪些内容？如果是跟省药检所买的3代菌是否就不用做纯度或确认试验？答：省所现在销售的是第二代的甘油冷冻管，严格来说，请做纯度确认。

      为什么有时候细菌管会长真菌，而真菌管也会长细菌。答：原因可能是多方面的，某些细菌适宜在真菌培养基上生长，而某些真菌也能在细菌培养基上生长。比如2010版药典无菌检查法，两种培养基的使用范围已删去，已不是绝对的细菌培养基或真菌培养基。

      在做方法验证时，黑曲霉菌浓度大于20cfu/皿时，培养5天后菌落蔓延扩散，无法各个区分，如何在药典要求的50~100cfu和实际操作结果中找到平衡？因为菌浓对回收率及操作RSD%影响很多.答：培养48-72h后，菌落刚形成时，及时点计并做记号，然后每天观察有无新的菌落长出并计数。

      标准菌黑曲霉在传代前需要先接到改良马丁培养基复苏后，再传代，如果需要，接到改良马丁培养基后培养时间怎么定？答：2010版药典规定 ，黑曲霉传代，培养时间为5~7天

      有时候在玫瑰红钠琼脂或营养琼脂平板上生长有酵母菌，在酵母菌生长的位置底部产生了一个气泡状的圆形，把底部的琼脂都贡起来了，又或者表面没有任何菌落，而琼脂被贡起来，请问这种圆形气泡是菌吗？在计数时是否也把它算入酵母菌？  答：建议挑取气泡内含物接种至改良马丁琼脂培养基中，若能生长，且为酵母菌的菌落形态，应该可以将其算入酵母菌。

      大肠生化实验中的靛基质试验（I）项结果为“+”或者“-”均不影响最终结果的判断，请问该项的意义何在？是否可以取消？答：反应为+，为典型大肠埃希氏菌，-为非典型大肠埃希菌。关系到最终判断，都是必须的实验，不可取消。

      生化检查用的鉴定盒是否需要跟培养基一样做适用性检查？如果需要做，应该如何进行？  答：用阳性菌做一次，实验结果相符即可。

      铜绿假单胞菌用什么方法保存及更活处理方法？答：建议采用甘油冻存管（终浓度为20%的甘油冻存管），-30℃（或更低温度）保存。

      工作菌种每代可保存多长时间（斜面低温保藏法）才传下一代？答：教科书上的保存时间为1-6个月。

      工作菌株的使用记录（时间、用途、使用者等）是否需要建立台账？答：是

      菌株的纯度和特性要多久确认一次，最短时间和最长时间分别是多少？  答：做标准储备菌株之前务必要进行鉴定，其它根据实际情况：如污染、活性下降、储存条件发上改变等。

      革兰氏染色前，菌落是否要先纯化（接到营养琼脂斜面上）还是直接从选择性培养基上挑起菌落直接染色？答：要纯化，从选择性培养基挑取单个菌落，最好先接到营养琼脂斜面后，再进行染色。

      真菌接至改良马丁液体培养基中，培养时间为多长？（白色念珠菌、黑曲霉）答：见2010版药典。

      菌种鉴定一定要做到生化鉴定吗？答：要。可以选择传统的生化试验鉴定，也可选择鉴定仪或鉴定试剂条。请视自身情况而定。

      是否可按10版药典中抑制控制菌检验判定方法进行？比如金葡菌做甘露醇平板分离，革兰染色，血浆凝固酶为阳性就可以了。答：金葡这样做可以。其他菌株视具体情况而选择适宜的鉴定试验。

      请介绍一下，有什么简便的方法灭菌甘油？答：高压湿热灭菌法

      黑曲霉孢子悬液贮存期验证怎么做。答：请参考前面该问题的答复。

      铜绿假单胞菌琼脂斜面变红，是否会造成菌种变异？如何避免该情况出现？（本菌株于25℃保存）答：出现这样的情况建议对菌种纯度进行鉴定。实验操作请注意防止污染。

      沙门菌穿刺于三塘铁琼脂斜面后，由试管底部向上分别出现黄→黑→红，三种颜色，如何解释？答：请看讲义内容。

      铜绿假单胞菌菌悬液是否也可在2~8℃保存，24小时内使用？答：不建议，请自己验证。

      是否一定要使用CMCC的菌株吗？答：药典是这样规定的。

      假如使用ATCC的菌株代替CMCC的可以吗？答：请按药典规定来进行实验，若是药品检验，请用CMCC菌株。

      可以用液氮保藏甘油冷冻管吗？可以的话应该怎么操作？答：可以。具体操作不清楚。我们没有液氮保存罐。

      贵所有开展支原体检查法这个实验吗？答：没有

      制备菌悬液的时候，培养物用的营养肉汤用量是多少？  答：没有具体规定，请自行制定。

      制备菌悬液的时候怎样保证他是50cfu呢？具体说一下操作方法  答：自行摸索一套方法，固定下来，以后就按该方法做就可以了。

      请问菌种斜面最好多长时间转接一次？答：参考上一题。

      20%甘油v∕v是用水还是用相应培养基做稀释？答：用相应的培养基。

      验证或做培养基的适用性检查时，若实际操作制得的菌悬液，经测定计数后不在规定的范围内，如＞100cfu，是否应判本次实验无效，应重试？若试菌，真菌生长较慢，不能短期内预算菌数，如何解决？答：第一个问题，请重试。第二个问题，请注意积累平时实验经验，标准化操作，慢慢摸索稀释的倍数。

      有时候酵母菌在玫瑰红钠平板上不易观察，是否可用孟加拉琼脂培养基代替来作培养？答：药品检验请严格按药典规定，若是平时科研，应该可以用孟加拉红琼脂培养基代替。

      菌种的每一次传代（如3代→4代→5代）都必须做菌种鉴定实验吗？答：视具体情况而定。

      如何控制菌液的浓度为50～100cfu/ml？答：见前面问题的回复。

      菌种的传代，营养肉汤或改良马丁0.5ml～0.8ml复苏冻干菌粉→直接涂布于营养琼脂培养基或改良马丁琼脂培养箱→是第一代还是第二代？答：冻干菌粉为第0代，若冻干菌粉未经过培养，直接涂布到培养基上，为第1代。

      请教一个有关微生物限度检查的问题，在制备10～100cfu菌液时除了你说的比浊法，比较普遍的就是平板计数法，而其中用到的六种试验菌，细菌用营养琼脂计数，霉菌用玫瑰红钠琼脂平板计数，其它四种菌应用何种培养基计数？答：不知道此处所说的其他4种指的是什么菌。

      只用平板计数，结果准确吗？还有没有其他方法制备10～100cfu菌悬液？答：这是一个很好的课题，若感兴趣，你们可以好好研究一下。

      什么叫比浊法（黑曲霉）？答：关于比浊法的定义和原理，请上网查百度百科，上面有详细的讲解。

      大肠埃希菌检查中，MUG培养基配制后显荧光是什么原因？答：有可能试管玻璃材质自发荧光，也可能清洗不干净，或培养基本身质量，比如有无发生污染等。

      请问可用何种培养基或手段鉴定枯草芽孢杆菌？eg：大肠埃希菌用EMB，金黄色葡萄球菌用甘露醇  答：目前尚未有合适的选择性培养来鉴定枯草芽孢杆菌，可选用API 或细菌鉴定仪等手段来鉴定。

      如何制备50~100cfu的悬液？有什么方法可以测定具体浓度？答：参考上题

      请问：细菌鉴定仪有哪些用途？能够鉴定沙门菌属下的各种沙门菌么？怎样应用？答：如有需要，可联系梅里埃的技术支持人员：13503006367 霍工。他会详细解答你想问的问题。

      黑曲霉菌在2~8℃保存经验证后能否延长使用时间？答：药典规定在验证过的期限内使用。

      菌种的保藏可否用液体石蜡保藏？与甘油冷冻保藏有何区别？答：药典未记载液体石蜡保藏法，部分参考书记载斜面保藏法或半固定保藏法可加灭菌石蜡覆盖。

     

暂无法回答的问题：

.用于验证试验的菌株是否经验证均能承受1000ml冲洗？答：未验证，请咨询药典会。

传代支原体和其它的菌种一样吗？答：不清楚

什么叫亚培养？答：请咨询药典会。

药典培训班问题解答6：

  问答

1、 供试品传入无菌，对表面进行消毒。用75%无菌酒精浸泡表面是否可行？可用如何方法。（等紫外照射1h+酒精喷射，是否可行？注：无缓冲间的情况。从一般区直接进入传递窗）

答： 用75%无菌酒精浸泡表面应该可行，但酒精易燃。  可用普通消毒剂如新洁尔灭等消毒。

2、 无菌实验供试品在传入无菌传递窗前能否泡消毒液？

答：视包装而定。如：玻璃安瓿，可以；西林瓶，不可以。

3、 检验针剂时，安瓿表面消毒可否用碘液浸泡作为消毒，如果可以，它会杀死样品本身的微生物吗？

答： 我们没有碘液浸泡消毒的经验。  就浸泡方式而言，视包装而定，如：玻璃安瓿，可以；西林瓶，不可以。

4、 微生物检查样品传递消毒处理，需作验证吗?如何确定其消毒效果？

答：验证当然最好，但也应结合常识、经验等，尽量减低工作量。

5、 药典要求只要供试品的特性允许优先考虑薄膜过滤法。对于小剂量无抑菌作用的注射剂，是直接接种法好还是薄膜过滤法好？

答：优先考虑薄膜过滤法，可视样品包装情况而定。

6、无菌检查验证，2010年版方法改变，变换了大肠埃希杆菌，请问从前经过验证的无菌检查方法，实施2010年药典时是否必须从新的验证方法进行验证？验证后从能进行无菌检查？ 

答：应重新验证。

8、无菌制剂的处方与工艺都没有改变，10版药典出版是否还需重新验证？

答：10版用大肠埃希替代铜绿假单胞，应重新验证。

9、05版我们已经做了方法验证，10版还要再做方法验证吗？

答：如前所述。

10、做阳性对照，为什么同是做5批检样，到最后只是两到三批长菌？原因出在哪？滤膜吗？（我们是做抗菌素的产品）

答：原因是多方面的。请考虑方法的耐用性；此外，操作前后是否一致（比如：供试品溶液溶解是否彻底、供试品溶液的浓度是否一致、对滤膜滤筒的湿润、每次过滤对滤筒的荡洗、抽干、抽干是否过久等等）等等都有可能是影响因素。

11、清洁无菌室所用消毒液如何做到无菌拖把、拖桶如何做到无菌？

答：消毒液可采用过滤的方法。无菌拖把、拖桶可采用浸泡、高温灭菌的方法。

12、微生物的操作记录，可否直接用电子版进行记录。也就是将操作结果及过程记录在电子系统内？如细菌培养时间为72小时，在操作规程上可否写成为72±2小时。生产企业可否将有菌种的检查项目，如方法学验证、培养基适用性检查委托有资格的单位检验？

答：可直接用电子版进行记录。  细菌培养时间为72小时，建议在操作规程上写成为72小时。    生产企业应该可将有菌种的检查项目，如方法学验证、培养基适用性检查委托有资质的单位检验。

13、高压消毒炉的培训一般在哪里有举行？

答：广州：特种设备培训机构锅炉所

14、化妆品微控的容器洗涤一般用什么洗涤较好？

答：表面活性剂

15、贵所日常所用的消毒液是哪些？

答：新洁尔灭、消毒粉、75%酒精、来苏儿。

16、消毒液本来就是用来消毒杀菌的，又怎么会存在消毒液是否无菌这一说法？ 

答：消毒液不是万能的，对绝大对数菌有效，不排除对有些微生物无效。  有些消毒剂质量难保证，如果有效成分浓度过低甚至无，则达不到灭菌效果。

17、能否直接用电磁炉煮培养基（加热）？最佳加热方法是？ 

答：电磁炉不能加热玻璃瓶。我们所：水浴（100℃），微波炉。  18、硫乙醇酸盐流体培养基培养后会有点浑浊（排除是菌生长），是否可以在灭菌之前过滤培养基?

答：找出培养基混浊的原因，若是培养基与样品发生作用导致的混浊，灭菌之前过滤培养基也是没用的。硫乙醇酸盐流体培养基含琼脂，如果用滤膜，一般很难过滤；如果用纱布、棉花、滤纸等，则须考虑滤材对不同成分的吸附程度不同，可能造成培养基成分比例的改变。

19、方法验证时：对照加的菌液是最后才加吗？ 

答：按药典，在最后一次冲洗液中加入。

20、培养基适用性检查无菌性检查中“每批培养基随机取不少于5支（瓶））中”中“每批”指脱水商品培养基的生产批次，还是指制备的批次？

答：指制备批次的培养基。

21、微生物检验用的各种试剂除了化学纯，能否使用分析纯？

答：可以。

22、生物安全柜，净化操作台每年是否需要检定？

答：是的，我所是每年检定一次。并定期检测洁净度，频次自己制订。

23、无菌操作时，对显微镜硬件条件的需求是怎样？

答：显微镜：至少1000X，也就说要有油镜。

24、生产原料药的公司，其微生物检测方法采用限度检查法，请问洁净室的划分中还需要建立“无菌检查室”吗？ 

答：只要满足药典规定的万级背景下的局部百级即可。

25、阳性接种室，有没有硬性要求在万级区域局部百级区域？

答：无硬性要求。但应使用生物安全柜，并按生物安全柜的要求设置外围空间。

26、 阳性操作间的空调系统是否应与微生物限度检查的空调系统完全分开，若未分开，是否可以采取直排的方式？（不利用阳性间的空调回风）

答：应分开。直排不等于分开。

27、微生物限度实验室和阳性对照室的洁净系统要分别独立，如用同一套的HVAC，但都是全排，是否能接受？

答：应分开。直排不等于分开。

28、微生物与无菌洁净系统也一定分别设置吗？ 

答：有条件最好将微生物限度检查与无菌检查洁净系统分开。

29、洁净区监控中，某些设备不宜采用冲淋法和接触碟法取样，而擦拭法中棉签释放率很低（普通棉签释放率只有20%左右）。请问如何设计采样方法才能真实反映设备表面微生物情况？ 

答：有些国外生产微生物检验仪器的大公司，有专用的小拭子，可能更有效。

30、用洁净服材质做成袋子来代替牛皮纸的包扎灭菌是否可行？

答：我们所目前采用此法。

31、环境监测用平皿预培养温度和时间?

答：30-35℃，时间不少于48h 

32、灵敏度检测如何确定接种菌数量？ 

答：菌液在接种至灵敏度检测用培养基的同时用微生物限度检查法的平皿法测定每1ml菌液的cfu。

33、如何验证消毒剂消毒效果？ 

答：目前没有统一的方法，自行设计。

34、消毒剂消毒效果如何验证？如何设定SAL接受标准？ 

答：目前没有统一的方法，自行设计。

35、验证试验中，若供试品需加入β-内酰胺酶，那么阳性对照管是否应该加入等量β-内酰胺酶？ 

答：验证试验时，不加，因为对照管是用于比较试验菌生长情况的。    检验时的阳性对照则加。

36、全封闭式无菌验证中，用0.9%Nacl溶液溶解后，抽入集菌器中，样品溶液是否要停留几秒钟？让样品与滤膜充分接触或者停留后溶液造成抗生素残角？如何停留几秒钟？应在100ml试停留还是50ml时停留合适？

答：不应停留，应让样品尽快通过，避免抑菌成分被吸附。薄膜过滤法的目的是仅让微生物截留在滤膜上。

37、每张滤膜每次冲洗量一般100ml，总冲洗量不得超过1000ml，若供试品容量较大，总供试品样品量按标准规定超过1000ml，那这种情况应如何看待呢？

答：中国药典未规定供试品溶液的体积，设计检验方法时，兼顾供试品溶液的浓度和体积，尽量采用较小的体积。

38、装消毒剂的容器是否要求灭菌？例如用可灭菌的不锈钢材质，因为塑料的容器不能灭菌问题。 

答：应该灭菌

39、配制用水最长可以放置多久？

答：视放置条件，经验证，自己设定。

40、对灭菌效果进行验证，多久进行一次？

答：根据自己工作情况，自己制订。

41、微生物限度检查时所用吸管是否均需计量？ 

答：无规定。

42、无菌，微生物限度实验，样品与阳性对照可以共用一个培养箱吗？答：有2种意见：其一，条件许可，分开，以免污染；其二，共用一个培养箱，使其在相同条件下培养。  我们：分开。

43、在无菌检查项下，供试品检验时，阳性对照是否必须每批都需做？是否供试品无菌试验跟阳性对照必须同步操作？

答：ChP要，同步。

44、      生产企业一次生产80mg/瓶的冻干粉36000瓶，企业取20瓶

做无菌检验，是否应另增加10瓶做阳性试验？（方法：薄膜过滤法，滤膜三分法，一份阳性，另两份置两种不同培养基中。

答：是，总共需30瓶。

45、      培养基灵敏度试验所用的菌种有6种，为什么没有大肠？

答：有专家解释：因铜绿与大肠均为革兰氏阴性杆菌，而铜绿在医院及自然界中更广泛存在，致病性更强。

46、      如果产品经无菌验证后，是以大肠为对照菌时，可行吗？

答：如果验证6种菌均可行，建议按药典阳性对照章节的要求，设定阳性对照菌。如果验证结果样品是抗革兰阴性菌的，则阳性菌应用大肠埃希菌。

47、      灵敏度试验可要加入大肠？

答：否。       

48、      薄膜过滤法中，菌悬液的加入，在最后一次的冲洗液中加入小

于100cfu的试验菌，过滤，这个说法用封闭式过滤器（）要如何做？如果做法是加入培养基后，再从管子里加1ml的100cfu的菌，可行吗？

答：在最后一次冲洗液中，经封闭式过滤器顶部的透气孔加入1ml的少于100cfu的菌液，抽干，再加培养基。

48、"全封闭式无菌检验中，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，我们验证的是50ml*3+100ml*3，总冲洗量不超1000ml,可行吗？"

答：可行。

49、《中国药典》无菌检查方法验证中“菌种加在最后一次冲洗液中，过滤”，如果某供试品无菌检查方法无需进行冲洗，那么菌悬液应该加在哪合适？

答：药典无规定，可在过滤完样品后直接加菌液，然后加入培养基。

50、"无菌验证后，试验菌数经测定，若加入菌数大于100cfu,该情况如何处理？是否需要判断其试验无效，重新验证" 

答：重新验证。

51、南方天气湿度大，易发霉，毛巾或者衣服上可能有黑色的霉点洗不干净，请问有没有好的方法去除霉点？

答：漂白、消毒。

52、粉针注射剂，同一个品种有不同规格的产品，在建立方法学验证时是否每个规格都需要进行验证？

答：理论上，以最大规格建立的方法应适用于其他较小规格。  但这样做可能会提高成本，因小规格的冲洗量、灭活剂等用量可能可以更少，难以一概而论。

53、无菌检查方法中阴性对照，每瓶溶剂，稀释液，冲洗液都需要收集，是不是每做一批试验，都需同时操作两台集菌仪？阴性对照能否每一批溶剂，稀释液，冲洗液抽一、两瓶做阴性对照？ 

答：不一定每做一批试验，都需同时操作两台集菌仪。  阴性对照不应该仅仅每一批溶剂，稀释液，冲洗液抽一、两瓶做阴性对照，应尽可能将所用到的每瓶都留少量做阴性。

54、"每一张膜总冲洗量不得超过1000ml,这个总冲洗量包括样品溶液吗？"

答：不包括。

55、无菌性检查，培养基是直接拿去培养，还是按照说明书灭菌处理后再拿去培养？ 

答：成品培养基直接培养；脱水培养基或自己配制的培养基灭菌后拿去培养。

56、液体硫乙醇酸盐培养基（中检所）极易被氧化，药检所做实验时是将管装量定在多高？

答：我们所用的是全封闭一次性滤筒，装量100ml，高度约6.5cm。57、如果培养过程氧化层高度已超过药典中要求的1/2高度，并发现其中长菌，结果如何判定？若未长菌，结果判定认为无菌是否成立？此类问题应该如何衡量？ 

答：如果培养过程氧化层高度已超过药典中要求的1/2高度，并发现其中长菌，可判断为不合格；    若未长菌，按药典，结果判定认为无菌应不成立；  此类问题应该照药典执行，培养后不超过1/2高度。

58、“无菌性检查中每批培养基随机取不少于5支（瓶）”,这句话中的“5支（瓶）”是5支或5瓶，还是5支和5瓶？”

答：或

59、洁净区与阳性实验室空调系统应如何分别设置？送风分离，回风分离，或两者均分离？即2套空调系统？

答：2套系统互不相干。

60、十四烷酸异丙酯若经验证后，不影响阳性菌生长，可否湿热灭菌？答：湿热灭菌的水蒸气可能会影响十四烷酸异丙酯的性能，建议按药典。

61、冲洗液的滤清，加入不浑浊，是否可不用过滤？

答：可

62、无菌检查时，阳性对照的接种与培养是否也必须和供试品培养同一天进行？ 

答：应同步操作。

63、使用的消毒剂应无菌，比如购买的新洁而灭要用无菌的4.5微米滤膜过滤再用吗？ 

答：如用在关键地方，建议过滤。

64、产品稳定性考察，有无菌检查项目，请问留样产品的无菌检查的数量和常规检查的数量要一样吗？如果是，留样量就会相当大，有的药品比较贵重，这样会造成企业较大的损失. 

答：无菌检查的数量和常规检查的数量应一样。  按药典稳定性试验指导原则附表，该做就应做，但若情况特殊，或许可减低检验频次，但如此一来，可能一些药品注册审评专家或GMP检查员会有不同意见。稳定性试验的无菌检查很大程度是在考察包装。

65、 做培养基适用性与方法验证时，若加菌量为100~120cfu＞100cfu，是否需要重新做验证？

答：要。

66、 药典只是提供了化药中干扰物的中和剂方法，能否提供一些中成药的除菌方法？ 

答：无

67、洁净区污染霉菌怎么处理？ 

答：可尝试甲醛熏蒸

68、洁净区有霉菌生长，要怎么净化环境？注：我们用75%的乙醇抹洗全部空间，然后开臭氧半小时，但是检测后还是发现有霉菌，老师是不是还有更好的方法？

答：可尝试甲醛熏蒸

69、老师说的酒精棉过一段时间会生长细菌，请问酒精棉保存期多久？ 

答：未考察，我们使用期一般不超过一周。

70、酒精棉怎样取样进行微生物检查？ 

答：请自行设计

71、酒精棉有规定超过多少的菌数不能再用？ 

答：无规定。

72、广州环凯有冻干菌粉卖，是否可以在其单位购买？

答：建议向中检所购买。

73、请问药典说“当产品的组分或原检验条件发生改变时，应对检验方法重新验证”，如何理解“原检验条件发生改变”

答：比如，将冲洗量500ml改为300ml，等等。

74、灵敏度检查：改良马丁和硫乙醇酸性流体培养基都要做6种菌株吗？ 

答：硫乙醇：4种，为金葡、铜绿、枯草、生孢；  马丁：2种，为百念、黑曲。

75、清洁后的洁具需用微生物纯化水洗涤？

答：清洁后的洁具需用纯化水洗涤。

76、无菌：阳性对照培养48~72小时就可以灭活了吗？不用跟供试品培养14天吗？

答：是的

77、供试品处理时，需加入适量的聚山梨酯80，聚山梨酯80需要灭菌吗？方法如何？ 

答：需灭菌，可采用湿热灭菌。

78、含0.05%（v∕v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液如何配制？答：可直接用聚山梨酯80配制，或先配制聚山梨酯80的浓溶液，然后取浓溶液作进一步配制。

79、如何证明“表面活性剂，中和剂或灭活剂使用应有效性及对微生物无毒性”？

答：自行设计

80、抗生素效价室放在洁净室里面是否合适？ 

答：应与洁净区分开。

81、最后灭菌产品的原辅料是否需要做微生物限度检查？

答；一般情况应做。

82、薄膜过滤法若试验冲洗量1000ml阳性用量多少？

答：也1000ml。

83、无菌用培养基是否不用对照培养基？

答：是

84、无菌检查法从开始制样到加入培养基也不能超过1h吗？ 

答：一般情况应该如此。

85、薄膜过滤法滤膜若＞50mm，冲洗量是否需调整？如何调整？ 

答：建议按药典规定，选用直径约50mm的滤膜。如要调整，即重新验证。

86、阳性菌接种使用生物安全柜后，那接种室的空调系统能否与微生物限度检查室共用？如果现在共用了，有什么方法能避免交叉污染？

答：请掌握原则，净化系统应分开。   

87、怎么消毒在试验中要用的无菌温度计？

答：我们没有这方面的经验。

88、发酵分装容器要预先灭菌，请问分装时是否有要求在无菌的环境下进行，分装后再进行灭菌，程序是否复杂化？

答：我们不明白该问题，一般而言，既然容器要预先灭菌，分装也应无菌操作。

89、无菌检查用的菌悬液是否必须用新鲜培养制备？用于制备菌悬液的培养物可否在25℃条件下连续使用一周？

答：请按药典10版要求，否则，自己验证。

90、灭菌锅压力表检定时，只检定了灭菌锅的温度是否可以？若只检压力呢?

答：请咨询检定机构。

91、薄膜过滤法检水验证？

答：不明白问什么。

92、洁净室的无菌采样区域是否相当预处理操作？

答：不明白问什么。

93、饮用水检测中GB标准中“总大肠菌群检出应进一步检验大肠埃希菌或耐热大肠菌群”，是否可以只做大肠埃希菌？

答：我们目前尚未开展水质检验。

相当于微生物知识普及了

不错的资料，谢谢！

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