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主题：【分享】如何解决色谱柱使用过程中出现的问题

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省部重点实验室
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发表于：2012/06/18 09:37:45 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
一、保留值与分离度重现性不好原因分析



问题

原因

表现


不同色谱柱间差异使用期间柱变化

填料、键合相不同

柱床破坏

键合相丢失

硅胶基质溶解

强保留组分堆积堵塞

保留因子(k), 分离因子(a)

柱效(N)

保留因子(k), 分离因子(a)

柱效(N)

保留因子(k), 柱效(N)


柱外效应

系统差异、进样量大、进样阀与色谱柱之间、色谱柱与检测器之间的管路太长、检测器流通池体积大、接头死体积大等。

柱效(N)


分离效果变差

流动相组分改变

流速改变

温度改变

保留因子(k)，柱效变化很小

保留因子(k), 分离因子(a)

保留因子(k), 柱效变化很小


柱平衡慢

重新平衡时间不够

保留因子(k), 柱效变化很小


柱超载

样品量太大

保留因子(k), 柱效(N)




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2012/6/18 9:39:39 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
二、造成色谱峰( 不对称)拖尾的原因

1．色谱柱本身填装问题,筛板堵塞或填料塌陷；

2．柱头有污染；

3．样品超载；

4．样品溶剂不合适；

5．柱外效应；

6．化学或二次保留(硅羟基)效应；

7． 缓冲容量不足或不合适；

8． 重金属污染。

三、如何解决峰形拖尾的问题

A. 与化学有关的拖尾问题

1．流动相中，加入30mM的三乙胺(用于碱性化合物)或醋酸胺(用于酸性化合物)， 未知化合物加醋酸三乙胺；

2．如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺(或醋酸二甲基辛胺)；

3.降低进样量至<1μg。

B. 与色谱柱有关的拖尾问题

1.如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96%的二氯甲烷与4%甲醇，加1%氢氧化铵混合液冲洗；正向柱可用甲醇冲洗；

2.使用保护柱。

C. 与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽

1.进样体积过大，(通常≤25μL)；

2.进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大(最佳连接管应<20cm，内径为0.007")；

3.检测器流通池的体积过大。
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省部重点实验室
gl19860312
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2012/6/18 9:40:27 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
四、如何贮存色谱柱

1.防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物,做到流动相用多少配多少, 或在水流动相中加200ppm的叠氮钠以抑制细菌生长(一定当心其毒性和潜在的爆炸性)；或在流动相中加20%的有机改性剂，也可抑制微生物生长， 有机改性剂还有助于流动相脱气。

2.尽可能将色谱柱贮存于100%有机溶剂(乙晴最好)中，避免在缓冲溶液中保存。

3.使用缓冲溶液后的色谱柱，应用15～20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水-有机溶剂流动相冲洗色谱柱，后换成100%有机溶剂贮存。

4.避免用纯水冲洗键合致密的C18柱。

5.将色谱柱的两端用堵头拧好，以免柱床填料干裂。
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dahua1981
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2012/6/19 8:44:27 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
各种色谱柱都全了
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