主题：【分享】48.10 5'-DFUR在小鼠结直肠癌模型内转化分析

【作者】 但操；

【导师】 张继民；

【作者单位】 广州医学院， 外科学，

【摘要】 研究背景:5’-脱氧氟尿苷（5’-deoxy-5-fluorouridine, 5’-DFUR）是临床治疗消化道恶性肿瘤的口服抗癌药物,为5-氟尿嘧啶（5-FU）的前体药物。其本身没有细胞毒作用,需要在细胞内经过胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase,TP）转化为5-FU才能发挥抗肿瘤作用。已有文献报道乳腺癌和胃癌细胞可以表达TP活性,而大肠癌细胞是否表达TP则持论不同。我们在前期研究中发现大肠癌组织中TP活性主要由间质细胞中的巨噬细胞表达,而测定6株结肠癌细胞系也几乎没有TP蛋白表达。在癌细胞不表达TP的情况下5’-DFUR在结直肠癌组织中如何转化尚属疑问。我们前期体内实验对结肠癌小鼠动物模型应用化疗药物5’-DFUR进行治疗,结果发现与5-FU相比平均荷瘤生存期更长,平均瘤重轻,同期平均体重下降缓慢,提示5’-DFUR在小鼠结肠癌组织比正常组织中转化率高,抗癌选择性高。其原因可能是TP酶在癌组织中分布较正常组织多。前期体外实验把5’-DFUR加入培养基中同人血单核细胞一起培养24h,5’-DFUR对4种癌细胞的IC50明显下降,提示血液中单核细胞也可表达TP。由于尚未发现实验比较在癌组织和血液中TP含量,故两者TP的含量高低尚需要实验进一步证实。本实验应用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）测定应用5’-DFUR后癌组织和血液中5-FU的转化情况,间接推断TP酶在癌组织和血液中分布差异,为进一步研究5’-DFUR在结直肠癌组织中转化及TP酶调控机制提供资料。实验材料:1、实验动物SPF级近交系BALB/c小鼠28只,6-8周龄,雄性,体重20.00±2.34g,购自广东省医学实验动物中心。2、肿瘤细胞株BALB/c小鼠结肠腺癌细胞株（CT26）,购自美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）。3、实验药物5’-DFUR由Roche公司日本研究中心提供; 5-FU注射液,江苏南通精华制药有限公司生产（批号: 080607）;5-FU标准品购自Sigma有限公司提供（批号: 097K1352）。4、实验仪器岛津高效液相系统;色谱柱:Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm,5μm）实验方法:1、小鼠结肠癌CT-26细胞株的培养10%胎牛血清1640培养基,含青霉素100×103 U/L和链霉素100 mg/L,37℃,5%CO2水浴恒温培养箱中培养,隔日换液,2-3天酶消化法传代。2、细胞悬液制备制备模型当天取指数生长期的细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,机械吹打成细胞悬液,2 000r/min离心5 min,弃上清液,加适量生理盐水调整细胞浓度至1×107个/ml,以台盼蓝测定细胞活力在95%以上。3、结肠癌模型制作方法将体外培养的CT26细胞悬液0.2ml注入小鼠（BALB/c）背部皮下,约2周后基本可以形成肉眼可见的肿瘤隆起。4、动物分组及给药荷瘤小鼠28只随机分为4组:①5’-DFUR给药15分钟组;②5’-DFUR给药30分钟组;③5-FU给药15分钟组;④5-FU给药30分钟组。根据动物体重,5-FU用量0.020mg/g ,配制浓度为1.0 mg/ml。5’-DFUR用量0.038mg/g;配置浓度为2.0mg/ml。各组分别腹腔注射给药15分钟、30分钟后处死小鼠立即取血和瘤组织。5、标本处理小鼠眼眶动静脉取血0.5 ml后放置入37℃水浴30分钟,3200rpm离心5min,取上清液4℃保存。肿瘤组织用滤纸吸干血迹后称重,然后按0.5g组织与4 ml生理盐水（1:8）加入匀浆器匀浆5min, 3200rpm离心5min,取上清液4℃保存。6、制作血液和肿瘤组织的5-FU药物标准曲线取未给药小鼠血清7份,每份90μL,分别加入由5-FU对照品和蒸馏水配制的系列标准液适量并混匀配成100μL,使血清中药物浓度分别为6.25,12.5,25.0,50.0,100.0,200.0,400.0μg·mL^-1,制作血清标准曲线;取未给药小鼠肿瘤组织匀浆液7份,每份90μL,分别加入由5-FU对照品和蒸馏水配制的系列标准液适量并混匀配成100μL,使肿瘤匀浆液中药物浓度分别为1.0,2.0,4.0,8.0,16.0,32.0,64.0μg·mL^-1,制作肿瘤标准曲线。7、测量各标本浓度取血清100μL,置于5mL玻璃试管中,加入乙酸乙酯2mL,漩涡振荡2min后,3200rpm离心5min,取上层析液置于另一玻璃试管中。再次加入乙酸乙酯2mL进行第二次提取,漩涡振荡2min后,3200rpm离心5min,取上层析液,然后合并两次提取的上层析液,离心浓缩挥干。加入100μL流动相定容,混匀取出,置于EP管中,10000rpm离心7min,取上层析液20μL进样。记录药物峰面积,代入相应标准曲线计算药物浓度;取肿瘤匀浆液100μL,以同样方法处理标本测量浓度。8、观测指标给药15分钟、30分钟处死组5’-DFUR组和5-FU组小鼠血液与癌组织5-FU浓度。9、统计学方法应用统计软件SPSS13.0数据包对5’-DFUR组和5-FU组小鼠血液与癌组织5-FU浓度采用配对样本t检验进行比较。当P<0.05时,认为差异有统计学意义。结果:1、注射药物5’-DFUR 15、30分钟后,癌组织转化的5-FU浓度分别54.64μg/g±12.80μg/g和45.58μg/g±18.82μg/g,血清中中5-FU浓度分别为8.83μg/ml±1.68μg/ml和9.82μg/ml±2.93μg/ml,15分钟、30分钟组癌组织5-FU浓度分别为血清的6.36、4.47倍（P<0.05）;2、注射药物5-FU 15、30分钟后,癌组织转化的5-FU浓度分别86.13μg/g±15.42μg/g和94.68μg/g±39.89μg/g,血清中5-FU浓度分别为133.35μg/ml±20.69μg/ml和112.70μg/ml±26.27μg/ml,15分钟、30分钟组血清5-FU浓度分别为癌组织的1.59、1.62倍（P<0.05）。结论:小鼠结肠癌模型体内,癌组织内5’-DFUR转化率高于血液,考虑分布在癌组织中的PyNPase酶比血液高。

【谱图】