主题：【原创】高效液相色谱法测定有关物质的方法建立的过程

                  高效液相色谱法测定有关物质的方法建立的过程
    有关物质系药品中除主成分以外的杂质，有关物质来源的两种途径：1.合成过程中的中间体和副产物；2.储存过程中产生的降解产物。
    由于有关物质的含量较少，所以选择专属性强、灵敏度高、重现性好的检测方法至关重要。目前常用的方法有HPLC法和TLC法，后法不讨论。现主要阐述HPLC法的建立过程。
    HPLC法检测有关物质的方法有：(1)杂质对照品法(适用于已知杂质)；(2)主成分自身稀释对照法(适用于一般杂质检查，杂质成分少且尚不能取得其对照品，简称“自身对照法”)；(3)归一化法 (现已不多用)。前法为外标法、定量检测；后两法均为限量检测。
一、色谱条件的确定
    1、查阅文献，看看是否同行已经做过类似的工作，有的话可以参考。
    2、没有文献，进行以下工作。
    1）分析结构，看看有无紫外吸收，有就比较简单，选用紫外检测器就行了，
没有的话那就麻烦，可以选用蒸发光散射检测器等。
    2）分析结构，看看选用何种色谱方式进行分离（正相或者反相色谱）。
    3）分析结构，看看流动相该如何选择，要不要选用一些离子对试剂。
    4）与同类产品进行比较。
    3、紫外扫描一下，找到最大吸收波长。将能得到的中间体、副产物、分解
产物、样品配成相同浓度，在紫外扫描分光光度计上扫描一下，选择所有物质具有相同的最大吸收处的波长作为测定波长。要是有二极管阵列检测器就不需要这一步了。
    4、还是得找一些资料，看看类似的样品的流动相，以它为起始流动相进行选择，如果没有，那就找专业书，看看它是怎么教你选择流动相的。
    5、通过专属性验证所选色谱条件能否将各杂质与被测物分离检出 。应按
0.5%(w／w)被测物浓度的各杂质量添加至被测物中，模拟被测物中可能存在杂质的状态，即有少量(约0.5%)杂质存在时能否与被测物达到完全分离(分离度大于2.0)，以验证系统适用性。
二、最低检测限
    得出达到S／N＝2或S／N＝3时的样品药品浓度。
三、供试品溶液浓度的确定
    根据最低检出浓度，采用“上推法”来确定供试品溶液浓度：如一般设定杂质总量小于1．0％对照液，对照溶液的浓度至少应为最低检出浓度的20---50倍，供试品溶液浓度则应是最低检出浓度的2000～5000倍。同时还应考虑仪器、色谱柱等因素对最低检出浓度和最大进样浓度的影响(即耐用性因素)，所以供试品溶液的浓度应在保证小于最大进样量的情况下，适当设定得高些，以保证该浓度在任何试验条件下，均有足够的检测灵敏度。
四、线性及精密度试验
    在稳定性考察中，如某杂质含量不断增加，则说明被测物降解的途径稳定、可循，则有必要对该杂质进行针对性地监控，即采用该杂质对照品 (经确证结构后，由人工合成获得)以外标法准确测定。此时，与含量测定相似，应进行线性试验。通常将杂质线性验证范围0．05%～1．5%)。且精密度试验也应符合要求，但RSD可根据实际情况，适当放宽至2.0～3.0。
五、加样回收率试验
    回收率试验采用在已知杂质含量的被测物中加入定量杂质的方法来评价。将各杂质以0.4%、0.5%、0.6% (w／w)的浓度加至被测物溶液中，以验证所采用的色谱条件是否可分离检测相应的各杂质以及与被测物中已存在的杂质是否累加，并观测累加量的准确性。
六、强力破坏试验
    强力破坏试验条件有强光、高温、高湿、强酸、强碱、氧化破坏等。破坏时不能过于剧烈，一般以产生20％～3O％杂质的条件为宜(《化学药物杂质研究技术指导原则》，国家食品药品监督管理局药品审评中心)。同时，还可采用二极管阵列检测器(DAD)或质谱(MS)监测器进一步验证主峰纯度，观察主峰中是否包含有被破坏产生的杂质峰。
七、其他色谱参数的确定
    流速的选择：主峰保留时间应在l0min以后，这样主峰不易出现拖尾、堆积的现象。柱温的选择：不应超过35℃，既可增强被测物与杂质的分离度，也可避免因温度过高使主峰降解，导致测定误差。
溶剂的选择：由于有关物质测定的供试品溶液浓度高，应首先考虑被测物在溶剂中的稳定性 和溶解性。一般选流动相作溶剂为宜， 以排除溶剂峰的干扰。但由于有关物质的测定必须扣除溶剂峰，因此只要溶剂峰不干扰被测物质峰，即使不选用流动相作溶剂，也完全可以。在流动相溶解性不佳时，可采用甲醇或乙腈作溶剂以提高溶解性。
    色谱图记录时间的设定：应能洗脱出有可能存在的全部杂质和经强力破坏试验产生的杂质，并规定至主成分保留时间的几倍为止。在测定制剂的有关物质时，个别辅料出峰滞后，此时应在质量标准中注明。
八、杂质的限量。
    必须根据《化学药物杂质研究技术指导原则》来定。